Les enzymes qui catalysent l’ubiquitination du phospho-IkB sont constitutivement actives. Par conséquent, la seule étape régulée qui dicte le devenir de IkB et NF-kB est dans la plupart des cas la phosphorylation des deux sérines N-terminales dans la molécule IkB. Comme le complexe E3IkB peut également être impliqué dans la dégradation de la CD4 et de la β-caténine, l’étape de phosphorylation est également celle qui fournit une spécificité à cette voie de signalisation., Il n’y a que deux exceptions à cette voie universelle pour l’activation de NF-kB. La première est l’activation du NF-kB en réponse au rayonnement UV, qui, bien que dépendant de la dégradation de L’IkB, n’implique pas de phosphorylation de L’IkB N-terminal (Bender et al., 1998; Li et Karin, 1998). La deuxième exception est l’anoxie, qui stimule la phosphorylation de L’IkBa à la tyrosine 42 (Imbert et al., 1996). Il a été suggéré que l’IkBa phosphorylé par la tyrosine se lie au domaine SH2 de la PI3 kinase, ce qui l’éloigne du NF-kB (Beraud et al., 1999)., Ce résidu de tyrosine à la position 42 D’IkBa, cependant, n’est pas conservé dans d’autres protéines IkB et donc l’universalité de cette voie est discutable. Le contrôle de la phosphorylation IkB en réponse à tous les autres stimuli activateurs NF-kB repose sur les épaules du complexe IkB kinase (IKK).
Une fois qu’il est devenu clair que l’événement clé dans l’activation de NF-kB était la phosphorylation IkB, la prochaine étape logique a été de rechercher une IkB kinase (IKK) sensible au stimulus qui pourrait catalyser cet événement., Cet effort a porté ses fruits il y a trois ans lorsqu’une protéine kinase phosphorylant spécifiquement les sérines régulatrices N-terminales D’IkBs et dont l’activité était fortement stimulée par le TNFa a été identifiée (DiDonato et al., 1997; Mercurio et coll., 1997). Cette activité IKK s’est avérée spécifique à la sérine et sensible à un certain nombre d’activateurs puissants de NF-kB en plus du TNFa, qui stimulent son activité avec des cinétiques qui correspondent à celles de la dégradation de L’IkBa (DiDonato et al., 1997). La mesure dans laquelle IKK est activé par un stimulus donné semble dicter la cinétique de la dégradation IkB., Des expériences de filtration sur Gel ont suggéré que L’IKK est un complexe protéique et en effet, la purification des protéines, le microséquençage et le clonage moléculaire ont jusqu’à présent permis d’identifier trois polypeptides IKK étroitement associés. Deux de ces polypeptides, IKKa (aussi appelé IKK1) et IKKß (IKK2) servent de sous-unités catalytiques de la kinase (DiDonato et al., 1997; Mercurio et coll., 1997; Zandi et coll., 1997, 1998), tandis que le troisième polypeptide, IKKy (également connu sous le nom de NEMO ou IKKAP1), Sert de sous-unité régulatrice (Mercurio et al., 1999; Rothwarf et coll., 1998; Yamaoka et coll., 1998).,
IKKa a également été isolé par un crible à deux hybrides sous forme de protéine qui interagit avec la MAP kinase kinase kinase (MAP3K), NIK (NF-kB inducing kinase) (Régnier et al., 1997). Bien que dans des expériences de surexpression dans des cellules de culture tissulaire, NIK agit comme un puissant activateur D’IKK et de NF-kB (Karin et Delhase, 1998; Malinin et al., 1997; Régnier et coll., 1997; Woronicz et coll., 1997), des expériences récentes remettent en question son implication dans L’activation de L’IKK par le TNFa ou l’IL-1 (Baud et al., 1999)., À l’appui de ces résultats basés sur des expériences de transfection transitoire, il a été récemment constaté que la mutation aly de la souris, qui entraîne la perte d’organes lymphoïdes, est une mutation ponctuelle dans le gène codant NIK (Shinkura et al., 1999). L’analyse de cellules dérivées de souris aly indique que L’activation de NF-kB par l’IL-1 et le TNFa est normale. Comme l’apparence phénotypique des souris aly est similaire à celle des souris déficientes en lymphotoxine (LT) (Shinkura et al., 1999), il est probable que NIK fonctionne comme médiateur de la signalisation LT et n’a aucun rôle dans la signalisation TNFa ou IL-1., Bien qu’une interaction entre NIK et IKKa ait été détectée dans des cellules de levure ou lors d’une surexpression des deux kinases dans des cellules de mammifères, jusqu’à présent, elle n’a pas été détectée dans des conditions physiologiques. En outre, la sous-unité IKKa, qui a été proposée Pour être la cible préférentielle pour NIK (Ling et al., 1998), n’est pas directement impliqué dans L’activation IKK (Delhase et al., 1999; Hu et coll., 1999).,
IKKa et IKKß ont des structures primaires très similaires (identité globale de 52%) et contiennent des domaines de protéine kinase à leurs termini N, et des motifs de fermetures éclair de leucine (LZ) et d’hélice – boucle – hélice (HLH) dans leurs parties C-terminales (Figure 2). IKKy ne contient pas de domaine catalytique reconnaissable mais est principalement composé de trois grandes régions α-hélicoïdales, dont une LZ (Figure 2). L’analyse biochimique de deux lignées cellulaires humaines indique que la forme prédominante D’IKK est un ikka: ikkß hétérodimère associé à un dimère ou à un trimère D’IKKy (Rothwarf et al., 1998)., Une quatrième protéine, une protéine associée au complexe IKK appelée IKAP, a été proposée Pour être impliquée dans L’activation IKK (Cohen et al., 1998). Cependant, comme IKAP n’est pas un constituant facilement détecté du complexe IKK, sa signification physiologique et sa fonction ne sont pas encore claires. En outre, l’analyse de séquence suggère que IKAP est l’homologue humain d’un des composants du complexe « Elongator » d’élongation transcriptionnelle de levure (Otero et al., 1999). Ainsi, IKAP est très probablement une protéine nucléaire et, par conséquent, est peu susceptible de servir de composant du complexe cytoplasmique IKK.,
les trois composantes de L’IkB kinase (IKK). Les principaux motifs structurels et fonctionnels D’IKKa, IKKß et IKKy sont indiqués., Kinase D, domaine kinase; LZ, fermeture éclair leucine; HLH, hélice – boucle – hélice; α, région hélicoïdale α capable de former des bobines enroulées
comme mentionné ci-dessus, les complexes IKK natifs purifiés à partir de cellules de mammifères semblent jusqu’à présent être assemblés uniquement à partir D’hétérodimères IKKa:IKKß plus sous-unités (rothwarf et al., 1998). In vitro, IKKa et IKKß peuvent former à la fois des homo-et des hétérodimères d’une manière qui dépend de l’intégrité de leurs motifs LZ (Zandi et al., 1998)., Il est donc possible que les hétérodimères IKKa:IKKß se forment d’abord et interagissent ensuite avec IKKy, ce qui Médie la formation d’un dimère de dimères. En effet, dans les cellules déficientes en IKKy, IKKa et IKKß sont présents dans un complexe de 300 kDa par opposition au grand complexe de 700 – 900 kDa présent dans les cellules de type sauvage (Yamaoka et al., 1998). Le petit complexe de 300 kDa est également détecté lorsque IKKa ou IKKß sont surexprimés (Zandi et al., 1997) et la réticulation indique que ce complexe est un dimère D’IKKa et D’IKKß (Zandi et al., 1998).,
lorsqu’elles sont examinées en tant que protéines marquées par épitope exprimées de façon transitoire dans des cellules de mammifères, IKKa et IKKß présentent des cinétiques d’activation et des spécificités de substrat identiques (Mercurio et al., 1997; Zandi et coll., 1997). Cependant, il est important de réaliser que bien que hautement reproductibles, de telles expériences sont quelque peu trompeuses car les protéines exprimées de manière transitoire s’échangent facilement avec leurs homologues endogènes et sont incorporées dans le grand complexe IKK (Zandi et al., 1997)., Ainsi, lorsque L’IKKa marqué par un épitope est précipité et que son activité kinase IkB associée est mesurée, il n’est pas clair si l’on mesure l’activité de la protéine IKKa exogène ou les activités de L’IKKa ou de L’IKKß endogènes avec lesquels elle s’associe. Même des mutants catalytiquement inactifs D’IKKa et D’IKKß se sont révélés associés à une quantité substantielle d’activité kinase IkB inductible par des cytokines lors de l’expression transitoire (Zandi et al., 1997)., Néanmoins, une grande surexpression d’IKKa ou D’IKKß catalytiquement inactifs peut inhiber L’activation du NF-kB en réponse au TNFa, mesurée par l’inhibition de la translocation nucléaire du RelA (Zandi et al., 1997).
Les activités kinases D’IKKa et D’IKKß et leurs capacités à être activées dépendent de leur dimérisation médiée par LZ, et les mutations LZ qui interfèrent avec ce processus abolissent L’activité kinase IkB (Zandi et al., 1997, 1998). L’activité IKKa ou IKKß est également abolie par des mutations dans le motif HLH (Zandi et al., 1997, 1998)., Les mutations HLH, cependant, n’interfèrent pas avec la dimérisation ou la liaison à IKKy. Au contraire, le motif HLH semble interagir avec le domaine kinase et peut stimuler son activité lorsqu’il est exprimé en trans(Delhase et al., 1999).
L’activation D’IKK dépend également de la présence d’une sous-unité IKKy intacte. Ni L’activité IKK ni NF-kB ne peuvent être déclenchées dans les cellules déficientes en IKKy après un traitement par TNFa, IL-1, endotoxine ou dsRNA (Yamaoka et al., 1998)., De plus, les complexes IKK assemblés sur un mutant de troncature D’IKKy qui n’a pas son LZ C-terminal sont réfractaires à tous ces agonistes (Rothwarf et al., 1998). Ces résultats fournissent une preuve génétique de l’importance D’IKK dans l’activation de NF-kB et suggèrent que la région C-terminale D’IKKy est nécessaire pour le recrutement d’activateurs en amont (vraisemblablement IKK-kinases ou IKK-Ks). De plus, la surexpression D’IKKy peut inhiber L’activation D’IKK en raison du titrage d’activateurs IKK limitatifs qui restent à identifier (Li et al., 1999b).,
L’Activation D’IKK dépend de la phosphorylation de sa sous-unité IKKß (Delhase et al., 1999). La première preuve d’un rôle de la phosphorylation dans L’activation de L’IKK a été obtenue par traitement du complexe IKK purifié et activé avec la protéine phosphatase 2A (PP2A), ce qui a entraîné L’inactivation de L’IKK (DiDonato et al., 1997). De plus, le traitement des cellules avec de l’acide okadaïque, un inhibiteur de la PP2A, entraîne une activation lente de L’IKK (et par conséquent du NF-kB). Plus récemment, il a été démontré que L’incubation de cellules avec le TNFa stimulait la phosphorylation des trois sous-unités IKK (Delhase et al., 1999)., IKKa et IKKß sont phosphorylés exclusivement sur les sérines, tandis que IKKy est phosphorylé sur la sérine et la thréonine. L’emplacement de ces sérines n’a été cartographié biochimiquement que pour IKKß, mais on peut supposer que les sites équivalents sont également phosphorylés sur IKKa. Deux des sérines phospho-accepteurs IKKß sont situées dans sa boucle d’activation (Delhase et al., 1999), une partie du domaine kinase qui est similaire à une région impliquée dans l’activation dépendante de la phosphorylation d’autres protéines kinases (Zheng et Guan, 1994)., Le plus souvent, la forme non phosphorylée de la boucle d’activation se replie sur le domaine kinase et interfère avec l’entrée d’ATP et de substrats peptidiques dans la poche catalytique. La Phosphorylation éloigne la boucle d’activation de la poche catalytique, permettant ainsi l’entrée et la liaison des substrats (Johnson et al., 1996). Le remplacement des deux sérines phospho-acceptantes (S177 et S181)dans la boucle T D’IKKß par des alanines empêche son activation, tandis que leur remplacement par des résidus de glutamate phospho-mimétique provoque une activation constitutive (Delhase et al., 1999; Mercurio et coll., 1997)., Fait intéressant, cependant, le remplacement des sérines équivalentes (S176 et S180) dans IKKa abolit L’autophosphorylation IKKa mais n’a aucun effet sur la stimulation de l’activité IKK totale associée au mutant IKKa(A176/A180) par le TNFa, L’IL-1 ou les kinases en amont MEKK1 et NIK (Delhase et al., 1999). Ces résultats ont été les premiers à mettre en évidence des différences fonctionnelles entre les deux sous-unités catalytiques, et ces résultats ont ensuite été confirmés par une analyse génétique., Sur la base de ces résultats, IKK est activé en réponse à des stimuli pro-inflammatoires par la phosphorylation D’IKKß; bien que la phosphorylation D’IKKa soit concurrente à celle d’IKKß, elle n’est pas essentielle pour la stimulation de L’activité IkB kinase. En d’autres termes, la sous-unité IKKß et non IKKa Sert de cible pour les activateurs en amont impliqués dans la signalisation pro-inflammatoire. Ces activateurs sont recrutés dans le complexe via la sous-unité IKKy, probablement par interaction avec son domaine C-terminal.
la Phosphorylation peut également entraîner une régulation négative de l’activité IKK., En plus de sa boucle d’activation, IKKß est largement phosphorylé dans une région située entre son motif HLH et le terminus C, qui contient plusieurs sérines (Delhase et al., 1999). La Phosphorylation de ces sérines dépend de l’activité de l’autokinase et se produit vraisemblablement après la phosphorylation de la boucle d’activation. Les expériences de mutagenèse indiquent que les sites D’autophosphorylation C-terminale sont impliqués dans la régulation à la baisse de l’activité kinase (Delhase et al., 1999)., Le remplacement de neuf ou dix des sérines C-terminales D’IKKß par des alanines donne un mutant qui reste actif quatre fois plus longtemps que l’enzyme de type sauvage, tandis que la substitution des mêmes sites par des résidus d’acide glutamique phosphomimétique donne une enzyme mutante qui peut difficilement être activée. Sur la base de ces résultats, un modèle en trois étapes a été proposé pour expliquer la régulation de L’activité IKK (Figure 3; Delhase et al., 1999). Initialement, le complexe IKK inactif n’est pas phosphorylé. En réponse à des stimuli en amont, les IKK-K sont activés et recrutés dans le complexe IKK via la sous-unité IKKy., Il en résulte une phosphorylation de la boucle D’activation IKKß et une activation de IKK. Il est probable que seule une petite fraction D’IKK est initialement activée par phosphorylation directe par IKK-Ks. Cependant, par trans-autophosphorylation, la sous-unité IKKß activée peut phosphoryler une sous-unité adjacente, qui peut être IKKa ou IKKß ainsi que d’Autres complexes IKK inactifs par une réaction intermoléculaire., À l’appui de cette hypothèse, la simple surexpression D’IKKß dans les cellules D’insectes Sf9 est suffisante pour son activation, et cette activation dépend absolument de son autophosphorylation. Les complexes IKK activés phosphorylent ensuite les sous-unités IkB dans les complexes NF-kB:IkB, déclenchant leur dégradation dépendante de l’ubiquitine, et l’activation de NF-kB. Simultanément et peut-être en raison de la diminution de L’abondance D’IkB, les sous-unités IKKß activées (et vraisemblablement les sous-unités IKKa également) subissent une autophosphorylation C-terminale., Cette réaction, qui est peu susceptible d’être processive, mais pourrait être régulée par le niveau D’IkB, fonctionne comme un dispositif de synchronisation tel que lorsqu’au moins neuf des sérines C-terminales sont phosphorylées, l’enzyme atteint un État de faible activité. Une fois à cet état, IKK devient sensible à l’inactivation par les phosphatases, surtout une fois que le signal amont a disparu., Comme les sites D’autophosphorylation C-terminale sont adjacents au motif HLH, ils peuvent exercer leur effet négatif sur l’activité kinase en modifiant la conformation de ce domaine activateur de kinase intrinsèque et en affectant son interaction avec le domaine catalytique. Ce mode de régulation explique pourquoi IKK est généralement activé de manière très transitoire.
Un modèle en trois étapes pour la régulation de IKK activité par phosphorylation., Les deux sous-unités catalytiques D’IKK (IKKa et IKKß) s’associent en un hétérodimère via leurs fermetures à glissière à leucine (LZ). Dans les cellules non stimulées, la boucle d’activation dans le domaine kinase (KD) n’est pas phosphorylée et le motif hélice – boucle – hélice (HLH) entre en contact avec le domaine kinase. Le groupe de phosphorylation C-terminale n’est pas non plus phosphorylé. Lors de la stimulation cellulaire avec le TNFa ou L’IL-1, la boucle d’activation D’IKKß est phosphorylée et par Trans-autophosphorylation de la deuxième sous-unité (IKKa ou IKKß, dans le cas d’un homodimère) IKK est activée., Une fois activé, en plus de la phosphorylation D’IkBs, IKK subit une autophosphorylation progressive au niveau de son cluster de sérine C-terminale. Lorsqu’au moins neuf des sérines C-terminales sont phosphorylées, la répulsion électrostatique modifie l’interaction entre le motif HLH activateur et le domaine kinase de telle sorte que la kinase atteint un État de faible activité., Dans cet état IKK est susceptible d’être plus enclin à l’inhibition par l’action de la phosphatase
En Raison de la capacité D’IKKß à propager son état actif par autophosphorylation, il est important de disposer d’un mécanisme pour diminuer son activité kinase et le rendre sensible à l’inactivation par une phosphatase. Sans autorégulation négative, un seul bolus d’une cytokine pro-inflammatoire pourrait entraîner une activation prolongée de L’IKK conduisant à une activation prolongée de la NF-kB suivie d’une augmentation de la production de médiateurs inflammatoires primaires et secondaires., Comme ces médiateurs peuvent provoquer une activation supplémentaire du NF-kB (Barnes et Karin, 1997), il existe un risque réel qu’en l’absence de mécanismes efficaces de rétroaction négative, même une insulte pro-inflammatoire mineure entraîne une catastrophe majeure, telle qu’un choc septique.
fait intéressant, cependant, l’activation constitutive de L’IKK peut se produire dans des États pathogènes et a été récemment documentée dans les cellules de la maladie de Hodgkin (Krappmann et al., 1999; examiné dans Rayet et Gélinas, 1999, ce numéro) et dans les lymphocytes T infectés par le HTLV-1 (Uhlik et al., 1998; revue dans Sun et Ballard, 1999, ce numéro)., Bien que les bases moléculaires de ces altérations du comportement de L’IKK soient inconnues, l’activation constitutive du NF-kB qui s’ensuit protège ces cellules de l’induction de l’apoptose par radio-et chimio-thérapie (Bargou et al., 1997). En fait, une activité élevée de NF-kB et D’IKK peut protéger de nombreux types de tumeurs des thérapies induisant l’apoptose (Gilmore, 1997). Ainsi, IKK est une cible attrayante pour le développement de nouveaux médicaments anti-tumoraux. Cependant, comme on le verra plus loin, l’inhibition complète de L’activité IKK est susceptible d’entraîner des effets secondaires indésirables.
