Ligasa de ADN T4: ¿la única ligasa que necesitarás?

Las ligasas de ADN, incluida la herramienta de biología molecular T4 DNA ligase, son enzimas que facilitan la Unión de las hebras de ADN catalizando la formación del enlace fosfodiéster entre los grupos 5′-PO4 y 3′-OH de la columna vertebral del ADN. En los organismos, la ADN ligasa juega un papel importante en la reparación de roturas en el ADN introducido durante la replicación y el daño, asegurando así la integridad de la información genética.,

El Descubrimiento de ligasas de ADN

dado su papel vital en la reparación y replicación del ADN, se propuso que la actividad de la ligasa de ADN en las células existiera incluso antes de su descubrimiento. Dos observaciones estimularon la búsqueda de ADN ligasas.

1. La ocurrencia de recombinación genética por rotura y re-unión de moléculas de ADN.
2. La formación de círculos cerrados por ADN lineal de bacteriófago I después de la infección.

en 1967, las ligasas de ADN fueron descubiertas de forma independiente por los laboratorios Gellert, Lehman, Richardson y Hurwitz., Desde su descubrimiento, las ADN ligasas se han convertido en herramientas importantes en la biología molecular. Las ligasas de ADN se utilizan en la clonación molecular para unir fragmentos de ADN para crear ADN recombinante, como cuando una pieza de ADN extraño se inserta en un plásmido.

La mayoría de las reacciones de ligadura involucran fragmentos de ADN que se han generado a partir de digests de restricción, con extremos cohesivos o Romos., La ligadura generalmente se realiza como una reacción separada después de la digestión de restricción, aunque algunos protocolos describen un método de clonación por PCR de un tubo donde se permite que la digestión de restricción y la ligadura ocurran simultáneamente en la misma reacción.

ligasa de ADN T4: ¿la única ligasa que necesitarás?

la ligasa de ADN T4 es la ligasa más utilizada en biología molecular. Al igual que sus parientes, ligasas T3 y T7, lleva el nombre del bacteriófago del que fue identificado por primera vez. Es una ligasa de ADN dependiente de ATP porque hidroliza ATP durante el enlace covalente de los grupos 5′-PO4 y 3′-OH.,

esta ligasa versátil se recomienda para la mayoría de las aplicaciones de clonación molecular de rutina, ya que puede ligar fragmentos de ADN de doble cadena romos y cohesivos (generalmente entre un vector de plásmido y un inserto), así como la clonación T/A.

debido a la versatilidad de la ligasa de ADN T4 en la ligadura de extremos cohesivos y romos, se ha optimizado para una gama de condiciones para una ligadura rápida y eficiente. Algunas variantes de la ligasa de ADN T4 han sido diseñadas para soportar altas sales y altas temperaturas de hasta 50°C., Tales ligasas de ADN son útiles para reacciones de ligadura con altas concentraciones de sal o temperaturas elevadas. Realizar la ligadura a temperaturas más altas reduce el tiempo de incubación y aumenta la especificidad de la ligadura. La ligasa de ADN T4 también se ha utilizado para la ligadura rápida, en la que la reacción se produce en 5 minutos a temperatura ambiente en lugar de durante la noche a 16°C, utilizando un tampón especialmente optimizado que aumenta la eficiencia de la ligadura. ¡Elija una ligasa de ADN rápida si tiene prisa!

entonces, ¿es la ligasa de ADN T4 la única ligasa que necesitará?, Bueno, si bien realiza muchas de las aplicaciones estándar de las ligasas de ADN en el laboratorio, tiene algunos inconvenientes.

no es particularmente tolerante a la sal

la actividad de las ligasas de ADN T4 comienza a disminuir rápidamente cuando las concentraciones de sal superan los 200 mM, por lo que si las condiciones para su ligadura implican altos niveles de sal (por ejemplo, cuando el arrastre de sal es un problema de los pasos anteriores), puede experimentar problemas y sería mejor elegir una ligasa alternativa.

afortunadamente, hay otras opciones disponibles., La ligasa de ADN T3, que también puede ligar fragmentos de ADN romos y pegajosos, puede tolerar concentraciones de sal de hasta 250-300 mm. sin embargo, esta no es su única opción. Se han creado Variantes de ligasa T4 que pueden soportar concentraciones de sal de hasta 500 mM, como la ligasa de ADN Salt-T4.

se ligan extremos romos, así como extremos cohesivos

mientras que esto inicialmente puede no parecer un problema, puede haber momentos en que usted tiene tanto cohesivo y el ADN de extremo romo en una reacción y solo desea ligar los extremos cohesivos., En esta situación, la ligasa de ADN T7 es su amiga, ya que no liga los extremos romos.

La ADN ligasa de E. coli es otra opción en este escenario. Esta ligasa no liga los extremos romos y tiene una afinidad más alta para los extremos cohesivos que la ligasa T4. La ligasa de ADN de E. coli es una ligasa dependiente de NAD+, por lo que el tampón que use será diferente de la ligasa T4.

puede ligar desajustes en Nicks

la ligasa de ADN T4 es una ligasa muy activa, y mientras que en general las ligasas de ADN prefieren ligar completamente el ADN pareado con base Watson-Crick, la ligasa T4 puede ligar desajustes en nicks de ADN., Si la ligadura de alta fidelidad de ADN Mellado es su objetivo, entonces la ligasa de ADN Taq dependiente de NAD + es la herramienta para el trabajo.

la ligasa de ADN Taq termoestable también es activa a temperaturas más altas (37-75oC). La capacidad de realizar ligaduras a temperaturas elevadas y la mayor fidelidad de las ligasas de ADN Taq reduce la incidencia de ADN recombinante no coincidente. Pero tenga en cuenta que esta enzima solo puede ligar las muescas y no los extremos romos o cohesivos.,

la ligadura selectiva de nicks por la ligasa de ADN Taq la convierte en la solución perfecta para técnicas donde solo se deben ligar nicks y se debe suprimir la ligadura final, como algunos métodos de ensamblaje de ADN. Hay numerosas aplicaciones que utilizan la ligadura de alta fidelidad de nicks por ligasa de ADN Taq incluyendo para la detección y cuantificación de polimorfismos de un solo nucleótido.

Descripción general de las aplicaciones de ligasa

mientras que la ligasa de ADN T4 puede ser la ligasa de elección para muchas aplicaciones de Biología molecular, no siempre es la mejor ligasa para el trabajo., Para obtener una visión general rápida de las características de las diferentes ligasas, consulte nuestra tabla de búsqueda rápida a continuación.

Keeping the above points in mind, it shouldn’t be difficult to choose a DNA ligase for your next ligation application!, ¿Utiliza una ligasa distinta de la T4? Deja un comentario a continuación.

lectura adicional

ADN ligasa, T4. In Worthington Enzyme Manual. Worthington Biochemical Corporation. (2019).

Shuman, S. DNA Ligases: Progress and Prospects. JBC. 284(26);17365–9 (2009). DOI 10.1074 / jbc.R900017200

tabla de selección de ligasa basada en sustrato. New England Biolabs.

tabla de selección de ADN ligasa. New England Biolabs.

Lehnman, I. R.. ADN ligasa: estructura, mecanismo y función. Ciencia, 186(4166);790-797 (1974). DOI: 10.1126 / ciencia.186.4166.,790

especificidad del sustrato y discriminación por desajuste en ADN ligasas. New England Biolabs