Un gel di agarosio con bande di DNA macchiato con bromuro di etidio e visualizzato sotto luce UV su un transilluminatore UV.
L’agarosio è una matrice preferita per il lavoro con proteine e acidi nucleici in quanto ha una vasta gamma di stabilità fisica, chimica e termica e il suo basso grado di complessità chimica lo rende anche meno probabile interagire con le biomolecole. L’agarosio è più comunemente usato come mezzo per la separazione elettroforetica su scala analitica nell’elettroforesi su gel di agarosio., I gel a base di agarosio purificato hanno una dimensione dei pori relativamente grande, che li rende utili per la separazione di grandi molecole, come proteine e complessi proteici >200 kilodaltons, così come frammenti di DNA >100 basepairs. L’agarosio è anche ampiamente utilizzato per una serie di altre applicazioni, ad esempio immunodiffusione e immunoelettroforesi, poiché le fibre di agarosio fungono da ancoraggio per immunocomplessi.,
Elettroforesi su gel di agarosomodifica
L’elettroforesi su gel di agarosio è il metodo di routine per risolvere il DNA in laboratorio. I gel di agarosio hanno un potere risolutivo inferiore per il DNA rispetto ai gel di acrilammide, ma hanno una maggiore gamma di separazione e sono quindi solitamente utilizzati per frammenti di DNA con lunghezze di 50-20.000 bp (coppie di basi), sebbene sia possibile una risoluzione di oltre 6 Mb con elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE)., Può anche essere usato per separare le grandi molecole della proteina ed è la matrice preferita per l’elettroforesi del gel delle particelle con i raggi efficaci più grandi di 5-10 nanometro.
La dimensione dei pori del gel influenza la dimensione del DNA che può essere setacciato. Più bassa è la concentrazione del gel, maggiore è la dimensione dei pori e maggiore è il DNA che può essere setacciato. Tuttavia i gel a bassa concentrazione (0,1-0,2%) sono fragili e quindi difficili da maneggiare e l’elettroforesi di grandi molecole di DNA può richiedere diversi giorni. Il limite di risoluzione per l’elettroforesi su gel di agarosio standard è di circa 750 kb., Questo limite può essere superato da PFGE, dove campi elettrici ortogonali alternati vengono applicati al gel. I frammenti di DNA si riorientano quando il campo applicato cambia direzione, ma le molecole più grandi di DNA impiegano più tempo per riallinearsi quando il campo elettrico viene alterato, mentre per quelle più piccole è più veloce, e il DNA può quindi essere frazionato in base alle dimensioni.
I gel di agarosio vengono gettati in uno stampo e, una volta impostati, di solito vengono eseguiti orizzontalmente immersi in una soluzione tampone., I tamponi Tris-acetato-EDTA e Tris-Borato-EDTA sono comunemente usati, ma altri tamponi come Tris-fosfato, barbiturico acido-sodio barbiturico o tamponi Tris-barbiturici possono essere utilizzati in altre applicazioni. Il DNA viene normalmente visualizzato colorando con bromuro di etidio e quindi visualizzato sotto una luce UV, ma sono disponibili altri metodi di colorazione, come il verde SYBR, il GelRed, il blu di metilene e il viola cristallino. Se i frammenti di DNA separati sono necessari per ulteriori esperimenti a valle, possono essere tagliati fuori dal gel in fette per ulteriori manipolazioni.,
Colonne di filtrazione in gel a base di agarosio utilizzate per la purificazione di proteine su una macchina AKTA FPLC.
Protein purificationEdit
La matrice di gel di agarosio viene spesso utilizzata per la purificazione delle proteine, ad esempio nella separazione in scala preparativa basata su colonne come nella cromatografia di filtrazione in gel, nella cromatografia di affinità e nella cromatografia a scambio ionico. Tuttavia non è usato come gel continuo, piuttosto è formato in perline porose o resine di varia finezza., Le perle sono altamente porose in modo che le proteine possano fluire liberamente attraverso le perle. Queste perle a base di agarosio sono generalmente morbide e facilmente schiacciate, quindi dovrebbero essere utilizzate in procedure a flusso gravitazionale, centrifugazione a bassa velocità o bassa pressione. La resistenza delle resine può essere migliorata aumentando la reticolazione e l’indurimento chimico delle resine di agarosio, tuttavia tali cambiamenti possono anche comportare una minore capacità di legame per le proteine in alcune procedure di separazione come la cromatografia di affinità.,
L’agarosio è un materiale utile per la cromatografia perché non assorbe biomolecole in misura significativa, ha buone proprietà di flusso e può tollerare estremi di pH e resistenza ionica nonché un’alta concentrazione di denaturanti come l’urea 8M o l’HCl di guanidina 6M. Esempi di matrice a base di agarosio per la cromatografia con filtrazione su gel sono Sepharose e WorkBeads 40 SEC (agarosio con perline reticolato), Praesto e Superose (agarosi con perline altamente reticolato) e Superdex (destrano legato covalentemente all’agarosio).,
Per cromatografia di affinità, l’agarosio bordato è la resina della matrice più comunemente usata per il collegamento dei leganti che legano la proteina. I ligandi sono collegati covalentemente attraverso un distanziatore a gruppi idrossilici attivati di polimero di perle di agarosio. Le proteine di interesse possono quindi essere legate selettivamente ai ligandi per separarli da altre proteine, dopo di che possono essere eluite. Le perle di agarosio utilizzate sono tipicamente di densità 4% e 6% con un’elevata capacità di legame per le proteine.,
Solid culture mediaEdit
La piastra di agarosio può talvolta essere utilizzata al posto dell’agar per la coltura di organismi poiché l’agar può contenere impurità che possono influenzare la crescita dell’organismo o alcune procedure a valle come la reazione a catena della polimerasi (PCR). L’agarosio è inoltre più duro dell’agar e può quindi essere preferibile dove la maggior forza del gel è necessaria e la sua temperatura di gelificazione più bassa può impedire lo shock termico all’organismo quando le cellule sono sospese in liquido prima della gelificazione., Può essere utilizzato per la coltura di batteri autotrofi rigorosi, protoplasti vegetali, Caenorhabditis elegans, altri organismi e varie linee cellulari.
3D Cell cultureEdit
L’agarosio è spesso usato come supporto per la cultura tridimensionale di cellule umane e animali. Poiché l’agarosio forma un idrogel non citotossico, può essere utilizzato per riprodurre l’ambiente naturale delle cellule nel corpo umano, la matrice extracellulare. Tuttavia, l’agarosio forma un idrogel inerte rigido che non trasporta alcuna informazione biologica, quindi le cellule umane e animali non possono aderire al polisaccaride., A causa di queste proprietà specifiche, l’idrogel di agarosio imita l’ambiente naturale delle cellule cartilaginee e ha dimostrato di supportare la differenziazione dei condrociti nella cartilagine. Al fine di modificare le proprietà meccaniche dell’agarosio per riprodurre l’ambiente naturale di altre cellule umane, l’agarosio può essere modificato chimicamente attraverso l’ossidazione precisa dell’alcool primario del D-galattosio in acido carbossilico. Questa modifica chimica fornisce una nuova classe di materiali denominati agarosio carbossilato., Attraverso il controllo del numero di D-galattosio carbossilato sulla spina dorsale del polisaccaride, le proprietà meccaniche dell’idrogel risultante possono essere controllate con precisione. Questi idrogel di agarosio carbossilato possono essere quindi legati covalentemente ai peptidi per formare idrogel su cui le cellule possono aderire. Questi idrogel di agarosio carbossilato hanno dimostrato di dirigere l’organizzazione delle cellule endoteliali umane in lumen polarizzati.La miscelazione di agarosio completamente carbossilato con agarosio naturale può essere utilizzata per produrre idrogel che coprono un’intera gamma di proprietà meccaniche.,
Test di motilità
L’agarosio è talvolta usato al posto dell’agar per misurare la motilità e la mobilità dei microrganismi. Le specie mobili saranno in grado di migrare, anche se lentamente, attraverso il gel poroso e i tassi di infiltrazione possono quindi essere visualizzati. La porosità del gel è direttamente correlata alla concentrazione di agar o agarosio nel mezzo, quindi diversi gel di concentrazione possono essere utilizzati per valutare la motilità del nuoto, dello sciame, del volo a vela e delle contrazioni di una cellula. Il saggio di migrazione cellulare sotto-agarosio può essere utilizzato per misurare la chemiotassi e la chemocinesi., Uno strato di gel di agarosio è posto tra una popolazione cellulare e un chemoattrattante. Mentre un gradiente di concentrazione si sviluppa dalla diffusione del chemoattrattante nel gel, varie popolazioni cellulari che richiedono diversi livelli di stimolazione per migrare possono quindi essere visualizzate nel tempo utilizzando la microfotografia mentre si tunnel verso l’alto attraverso il gel contro la gravità lungo il gradiente.
