as enzimas que catalisam a ubiquitinação do fosfo-IkB são constitutivamente ativas. Assim, a única etapa regulamentada que dita o destino do IkB e NF-kB é, na maioria dos casos, a fosforilação das duas serinas n-terminais na molécula IkB. Como o complexo E3IKB também pode estar envolvido na degradação da CD4 e β-catenina, o passo de fosforilação é também o que fornece especificidade a esta via de sinalização., Existem apenas duas exceções a esta via universal para ativação NF-kB. A primeira é a ativação de NF-kB em resposta à radiação UV, que embora dependente da degradação IkB não envolve fosforilação N-terminal IkB (Bender et al., 1998; Li e Karin, 1998). A segunda exceção é a anóxia, que estimula a fosforilação do IkBa na tirosina 42 (Imbert et al., 1996). O IkBa fosforilado de tirosina tem sido sugerido para se ligar ao Domínio SH2 de PI3 kinase, que o puxa para longe de NF-kB (Beraud et al., 1999)., Este resíduo de tirosina na posição 42 do IkBa, no entanto, não é conservado noutras proteínas do IkB e, por conseguinte, a universalidade desta via é questionável. O controlo da fosforilação IkB em resposta a todos os outros estímulos activadores NF-kB assenta nos ombros do complexo IkB kinase (IKK).
Uma vez que ficou claro que o evento chave na ativação NF-kB era a fosforilação IkB, o próximo passo lógico era procurar por uma Kinase IkB sensível ao estímulo (IKK) que pudesse catalisar este evento., Este esforço deu frutos há três anos, quando foi identificada uma proteína cinase que fosforila especificamente as serinas reguladoras n-terminais do IkBs e cuja actividade foi grandemente estimulada pelo TNFa (DiDonato et al., 1997; Mercurio et al., 1997). Esta actividade do IKK demonstrou ser específica em Serina e responder a uma série de activadores potentes NF-kB, para além do TNFa, que estimulam a sua actividade com cinética que corresponde às da degradação do IkBa (DiDonato et al., 1997). A medida em que o IKK é activado por um dado estímulo parece ditar a cinética da degradação do IkB., As experiências de filtração em Gel sugeriram que o IKK é um complexo proteico e, na verdade, a purificação de proteínas, a microequenciação e a clonagem molecular resultaram até agora na identificação de três polipéptidos estreitamente associados ao IKK. Dois destes polipeptídeos, IKKa (também chamado IKK1) e IKKß (IKK2) servem como subunidades catalíticas da cinase (DiDonato et al., 1997; Mercurio et al., 1997; Zandi et al., 1997, 1998), enquanto o terceiro polipeptídeo, IKKy (também conhecido como Nemo ou IKKAP1), serve como sua subunidade regulamentar (Mercurio et al., 1999; Rothharf et al., 1998; Yamaoka et al., 1998).,
IKKa também foi isolado através de uma tela de dois híbridos como uma proteína que interage com o mapa kinase kinase kinase (MAP3K), NIK (NF-kB inducing kinase) (Régnier et al., 1997). Embora em experimentos de sobreexpressão em células de cultura de tecidos NIK atua como um ativador potente de ambos IKK e NF-kB (Karin e Delhase, 1998; Malininin et al., 1997; Régnier et al., 1997; Woronicz et al., 1997), experiências recentes questionam o seu envolvimento na activação do IKK por TNFa ou IL-1 (Baud et al., 1999)., Em apoio a estes resultados baseados em experiências de transfecção transitória, descobriu-se recentemente que a mutação aly do rato, que resulta na perda de órgãos linfóides, é uma mutação pontual no gene que codifica NIK (Shinkura et al., 1999). A análise de células derivadas de ratinhos aly indica que a ativação mediada por IL-1 e TNFa de NF-kB são normais. Uma vez que o aspecto fenotípico dos ratinhos aly é semelhante ao dos ratinhos com deficiência de linfotoxina (LT) (Shinkura et al., 1999), é provável que NIK funciona como um mediador da sinalização LT e não tem papel na sinalização TNFa ou IL-1., Embora tenha sido detectada uma interacção entre o Nik e o IKKa nas células de levedura ou após sobre-expressão das duas cinases nas células de mamíferos, até agora não foi detectada em condições fisiológicas. Além disso, a subunidade IKKa, que foi proposta para ser o alvo preferencial para a NIK (Ling et al., 1998), não está directamente envolvido na activação do IKK (Delhase et al., 1999; Hu et al., 1999).,
IKKa e IKKß têm estruturas primárias muito semelhantes (52% identidade global) e contêm domínios de proteína cinase no seu terminal N, e leucina zippers (LZ) e helix – loop – helix (HLH) em suas porções C-terminal (Figura 2). IKKy não contém um domínio catalítico reconhecível, mas é composto principalmente de três grandes regiões α-helicoidais, incluindo um LZ (Figura 2). A análise bioquímica de duas linhas celulares humanas indica que a forma predominante de IKK é um heterodímero IKKa:IKKß associado a um dímero ou trímero de IKKy (Rothharf et al., 1998)., A fourth protein, an IKK complex-associated protein called IKAP, has been proposed to be involved in IKK activation (Cohen et al., 1998). No entanto, como o IKAP não é um componente facilmente detectado do complexo IKK, o seu significado fisiológico e função ainda não são claros. Além disso, a análise sequencial sugere que o IKAP é o homologo humano de um dos componentes do complexo de alongamento transcritional da levedura (Otero et al., 1999). Assim, o IKAP é muito provavelmente uma proteína nuclear e, portanto, é improvável que sirva como um componente do complexo citoplasmático IKK.,
Os três componentes do IkB quinase (IKK). São indicados os principais motivos estruturais e funcionais da IKKa, da IKKß e da IKKy., Quinase D, domínio quinase; LZ, zíper de leucina; HLH, helix – loop – helix; α, α helicoidal região capazes de formação de coiled-coils
Como mencionado acima, nativo IKK complexos, purificada a partir de células de mamíferos até agora parecem ser montadas apenas a partir de IKKa:IKKß heterodimers além de um número indeterminado de IKKy subunidades (Rothwarf et al., 1998). In vitro, IKKa e IKKß podem formar homo-e heterodímeros de uma forma que depende da integridade dos seus motivos LZ (Zandi et al., 1998)., Portanto, é possível que IKKa: ikkß heterodímeros formem primeiro e depois interajam com IKKy, que Media a formação de um dímero de dímeros. De facto, nas células deficientes em IKKy, a IKKa e a IKKß estão presentes num complexo de 300 kDa, em oposição ao grande complexo de 700-900 kDa presente em células de tipo selvagem (Yamaoka et al., 1998). O pequeno complexo de 300 kDa também é detectado quando IKKa ou IKKß são sobreexpressos (Zandi et al., 1997) e crosslinking indica que este complexo é um dímero de IKKa e IKKß (Zandi et al., 1998).,quando examinadas como proteínas epitópicas de expressão transitiva em células de mamíferos, a IKKa e a IKKß apresentam uma cinética de activação idêntica e especificidades do substrato (Mercurio et al., 1997; Zandi et al., 1997). No entanto, é importante perceber que, embora altamente reprodutíveis, tais experiências são um pouco enganosas, porque as proteínas expressas transitoriamente facilmente se trocam com as suas homólogas endógenas e são incorporadas no grande complexo IKK (Zandi et al., 1997)., Assim, quando o IKKa marcado com epítopo é precipitado e a sua actividade cinase associada é medida, não é claro se se está a medir a actividade da proteína IKKa exógena ou as actividades do IKKa endógeno ou do IKKß com que se associa. Verificou-se que mesmo mutantes cataliticamente inactivos da IKKa e da IKKß associam-se a uma quantidade substancial de actividade de cinase indutível da citoquina na sequência de uma expressão transitória (Zandi et al., 1997)., No entanto, uma vasta sobreexpressão de IKKa ou IKKß cataliticamente inactivos pode inibir a activação de NF-kB em resposta ao TNFa, medida pela inibição da translocação nuclear de RelA (Zandi et al., 1997).
As actividades cinase do IKKa e do IKKß e as suas capacidades para serem activadas dependem da sua dimerização mediada pela LZ, e das mutações LZ que interferem com este processo abolem a actividade da kinase IkB (Zandi et al., 1997, 1998). A actividade do IKKa ou do IKKß também é abolida por mutações dentro do motivo HLH (Zandi et al., 1997, 1998)., As mutações HLH, no entanto, não interferem com a dimerização ou ligação a IKKy. Pelo contrário, o motivo HLH parece interagir com o domínio da cinase e pode estimular a sua actividade quando expresso em trans (Delhase et al., 1999).a activação do IKK também depende da presença de uma subunidade IKKy intacta. Nem o IKK nem a actividade NF-kB podem ser induzidos em células deficientes em IKKy após tratamento com TNFa, IL-1, endotoxina ou dsRNA (Yamaoka et al., 1998)., Além disso, complexos de IKK montados em um mutante truncado de IKKy que não tem sua LZ C-terminal são refratários a todos esses agonistas (Rothharf et al., 1998). Estes resultados fornecem uma prova genética da importância do IKK na activação do NF-kB e sugerem que a região C-terminal do IKKy é necessária para o recrutamento de activadores a montante (presumivelmente IKK-kinases ou IKK-Ks). Além disso, a sobreexpressão do IKKy pode inibir a activação do IKK devido à titulação dos activadores limitantes do IKK que ainda não foram identificados (Li et al., 1999b).,a activação do IKK depende da fosforilação da sua subunidade IKKß (Delhase et al., 1999). A primeira evidência de um papel para a fosforilação na ativação do IKK foi obtida por tratamento do complexo IKK purificado e ativado com proteína fosfatase 2A( PP2A), o que resultou na inativação do IKK (DiDonato et al., 1997). Além disso, o tratamento de células com ácido okadaico, um inibidor PP2A, resulta na ativação lenta do IKK (e consequentemente NF-kB). Mais recentemente, a incubação de células com TNFa mostrou estimular a fosforilação das três subunidades do IKK (Delhase et al., 1999)., O IKKa e o IKKß são fosforilados exclusivamente em serinas, enquanto o IKKy é fosforilado em Serina e treonina. A localização destas serinas foi mapeada bioquímicamente apenas para a IKKß, mas pode-se assumir que os locais equivalentes também são fosforilados na IKKa. Duas das serinas ikkß phospho-acceptor estão localizadas no seu ciclo de ativação (Delhase et al., 1999), uma porção do domínio da cinase que é semelhante a uma região envolvida na ativação dependente da fosforilação de outras proteínas cinases (Zheng e Guan, 1994)., Mais frequentemente, a forma não fosforilada do laço de activação volta para o domínio da cinase e interfere com a entrada de substratos de ATP e peptídeo no bolso catalítico. A fosforilação afasta o laço de ativação do bolso catalítico, permitindo assim a entrada e ligação de substratos (Johnson et al., 1996). A substituição das duas serinas que aceitam fosfo (S177 e S181) no laço T do IKKß por alaninas impede a sua activação, enquanto a sua substituição por resíduos fosfo-miméticos do glutamato causa activação constitutiva (Delhase et al., 1999; Mercurio et al., 1997)., Curiosamente, no entanto, a reposição do equivalente serines (S176 e S180) em IKKa abole IKKa autophosphorylation mas não tem efeito sobre a estimulação do total de IKK atividade associada com a IKKa(A176/A180) mutante por TNFa, IL-1 ou a montante cinases MEKK1 e NIK (Delhase et al., 1999). Estes resultados foram os primeiros a apontar diferenças funcionais entre as duas subunidades catalíticas, e estes resultados foram posteriormente confirmados pela análise genética., Com base nestes resultados, o IKK é activado em resposta a estímulos pró-inflamatórios através da fosforilação do IKKß; embora a fosforilação do IKKa seja concomitante com a do IKKß, não é essencial para a estimulação da actividade da IkB cinase. Por outras palavras, a subunidade IKKß e não o IKKa serve de alvo para activadores a montante envolvidos na sinalização pró-inflamatória. Estes activadores são recrutados para o complexo através da subunidade IKKy, muito provavelmente através da interacção com o seu domínio C-terminal.a fosforilação pode também resultar numa regulação negativa da actividade do IKK., Além do seu ciclo de ativação, o IKKß é extensivamente fosforilado dentro de uma região localizada entre o seu motivo HLH e o terminal C, que contém múltiplos serinos (Delhase et al., 1999). A fosforilação destas serinas depende da actividade da autocinase e presumivelmente ocorre após a fosforilação do ciclo de activação. As experiências de mutagénese indicam que os locais de autofosforilação C-terminal estão envolvidos na redução da actividade cinase (Delhase et al., 1999)., A substituição de nove ou dez das serinas C-terminal de IKKß por alaninas resulta em um mutante que permanece ativo quatro vezes mais do que a enzima de tipo selvagem, enquanto a substituição dos mesmos locais por resíduos de ácido glutâmico fosfomimético resulta em uma enzima mutante que dificilmente pode ser ativada. Com base nestes resultados, foi proposto um modelo em três fases para explicar a regulação da actividade do IKK (Figura 3; Delhase et al., 1999). Inicialmente, o complexo IKK inactivo não é fosforilado. Em resposta a estímulos a montante, IKK-Ks são ativados e recrutados para o complexo IKK através da subunidade IKKy., Isto resulta na fosforilação do ciclo de activação do IKKß e na activação do IKK. É provável que apenas uma pequena fracção do IKK seja inicialmente activada através da fosforilação directa pelo IKK-Ks. No entanto, através da trans-autofosforilação a subunidade ativada IKKß pode fosforilar uma subunidade adjacente, que pode ser IKKa ou IKKß, bem como outros complexos inativos IKK através de uma reação intermolecular., Em apoio desta suposição, a mera sobreexpressão de IKKß nas células de inseto Sf9 é suficiente para sua ativação, e esta ativação é absolutamente dependente de sua autofosforilação. The activated IKK complexes then phosphorylate IkB subunits in NF-kB: IkB complexes, triggering their ubiquitin-dependent degradation, and the activation of NF-kB. Simultaneamente e talvez devido à diminuição da abundância do IkB, as subunidades ikkß ativadas (e presumivelmente as subunidades IKKa também) passam por autofosforilação C-terminal., Esta reacção, que é pouco provável de ser processiva, mas pode ser regulada pelo nível do IkB, funciona como um dispositivo de regulação tal que, quando pelo menos nove das serinas C-terminal são fosforiladas, a enzima atinge um estado de baixa actividade. Uma vez neste estado, o IKK torna-se sensível à inactivação por fosfatases, especialmente quando o sinal a montante desapareceu., Como os locais de autofosforilação C-terminal são adjacentes ao motivo HLH, eles podem exercer seu efeito negativo sobre a atividade cinase, alterando a conformação deste domínio ativador cinase intrínseco e afetando sua interação com o domínio catalítico. Este modo de regulação explica porque é que o IKK é normalmente activado de uma forma altamente transitória.
Um dos três passos do modelo de regulamento de IKK atividade por fosforilação., As duas subunidades catalíticas do IKK (IKKa e IKKß) associam-se a um heterodímero através dos seus fechos de leucina (LZ). Em células não estimuladas, o ciclo de ativação dentro do domínio cinase (KD) não é fosforilado, e o motif helix – loop – helix (HLH) contacta o domínio cinase. O aglomerado de fosforilação C-terminal também não é fosforilado. Após estimulação celular com TNFa ou IL-1, o ciclo de ativação do IKKß é fosforilado e através da trans-autofosforilação da segunda subunidade (IKKa ou IKKß, no caso de um homodímero) IKK é ativado., Uma vez ativado, além da fosforilação do IkBs, o IKK sofre uma autofosforilação progressiva no seu aglomerado de serina C-terminal. Quando pelo menos nove das serinas c-terminais são fosforiladas, a repulsão electrostática altera a interacção entre o motivo HLH activador e o domínio da cinase de modo a que a cinase atinja um estado de actividade baixa., Neste estado IKK é susceptível de ser mais propenso a inibição por fosfatase ação
Devido a capacidade de IKKß para propagar seu estado ativo através de autophosphorylation é importante ter um mecanismo para diminuir a sua atividade quinase e torná-lo sensível à inativação por uma fosfatase. Sem auto-regulação negativa, um único bólus de uma citoquina pró-inflamatória poderia resultar em Ativação prolongada do IKK levando a ativação prolongada do NF-kB, seguida pelo aumento da produção de mediadores inflamatórios primários e secundários., Como estes mediadores podem causar mais ativação NF-kB (Barnes e Karin, 1997), existe um risco genuíno de que, na ausência de mecanismos eficientes de feedback negativo, mesmo um pequeno insulto pró-inflamatório resultaria em uma grande catástrofe, como choque séptico.curiosamente, no entanto, a ativação constitutiva do IKK pode ocorrer em Estados patogênicos e foi recentemente documentada em células da doença de Hodgkin (Krappmann et al., 1999; revised in Rayet and Gélinas, 1999, this issue) and in HTLV-1-infected T cells (Uhlik et al., 1998; revista em Sun e Ballard, 1999, esta edição)., Embora as bases moleculares para estas alterações no comportamento do IKK sejam desconhecidas, a ativação constitutiva NF-kB que se segue protege estas células da indução da apoptose por rádio e quimio-terapia (Bargou et al., 1997). De facto, a elevada actividade NF-kB e IKK pode proteger numerosos tipos de tumores de terapias indutoras de apoptose (Gilmore, 1997). Assim, IKK é um alvo atraente para o desenvolvimento de novas drogas anti-tumor. No entanto, como será discutido a seguir, é provável que a inibição completa da actividade do IKK resulte em efeitos secundários indesejáveis.
