Rearranjos recorrentes de inversão do ADN no genoma humano

resultados

fundamentação para a análise da dinâmica do Genoma Humano.

para estudar a dinâmica do genoma humano, temos como alvo a detecção de breakpoints de rearranjo cromossómico. Isto requer a disponibilidade de uma sequência de referência Genómica de muito alta qualidade. A sequência atual do genoma humano atende a esses padrões de qualidade, contendo poucas lacunas com uma taxa de erro estimada muito baixa (26)., Para este estudo, o National Center for Biotechnology Information (NCBI) construiu 36 versão da sequência do genoma de referência humana.

para identificar potenciais locais para NAHR, a sequência de genoma de referência humana foi primeiramente analisada para encontrar regiões cromossômicas de identidade de alta sequência. Se ocorrer um evento de recombinação NAHR, espera-se que novas estruturas genômicas sejam formadas., Além disso, se estes eventos ocorreram em células somáticas, então essas novas estruturas genômicas seriam previstas para estar presente em uma fração muito pequena do total de células sendo analisadas, com a grande maioria das células contendo a estrutura genômica não-combinada correspondente (aqui referido como estruturas de tipo selvagem). Evidências disso podem ser encontradas em outros organismos, como bactérias (24, 25). Assim, para identificar tais rearranjos cromossômicos, é necessário um procedimento experimental muito sensível e específico., Na nossa opinião, neste momento, a técnica de escolha para este tipo de estudo seria um ensaio baseado em PCR utilizando primadores de oligonucleótidos adequadamente definidos.

O presente estudo centra-se nas inversões de ADN derivadas de eventos NAHR entre pares de sequências repetidas localizadas na orientação inversa que podem gerar inversões de ADN. O regime apresentado na Fig. 1 a exemplifica um par de estruturas de tipo selvagem, denotadas como a e b, e o rearranjo de inversão correspondente que pode ser produzido por NAHR (Fig. 1 B), juntamente com os iniciadores PCR necessários para detectar as diferentes estruturas., Os primers devem corresponder as regiões próximas, embora externas, às repetições. Se os iniciadores dianteiros e invertidos que flanqueiam uma das repetições forem utilizados para o ensaio PCR, é detectada a estrutura correspondente do tipo selvagem(Fig. 1 a). Um ponto de ruptura de inversão pode ser detectado usando ambos os iniciadores dianteiros (Fa e Fb) ou ambos iniciadores inversos (Ra e Rb) (Fig. 1 B). De acordo com a posição dos iniciadores correspondentes na sequência nucleotídica, o tamanho exato do fragmento PCR esperado pode ser calculado.

selecção de sequências repetidas para analisar a dinâmica do genoma.

as regiões genômicas a serem estudadas foram selecionadas por um procedimento bioinformático multi-passo esquematizado na Fig. 2., O primeiro passo consistiu na identificação de todos os pares de sequências invertidas intracromossómicas formadas por dois núcleos, a e b, de pelo menos 400 nucleótidos de comprimento partilhando 100% de identidade sequencial (ver materiais e métodos). Estes pares de sequências são aqui referidos como potenciais sequências recombinogénicas invertidas (PRIS) (Fig. 2 A). Um total de 24.547 PRIS foram encontrados no NCBI Build 36 do genoma de referência humano. Os PRIS são distribuídos entre todos os 24 cromossomas diferentes, e os núcleos que compõem estes PRIS variaram em comprimento de 400 a 74.868 nucleótidos., O número total de nucleótidos presentes no PRIS não-endêmico foi de 31.115.694 bp, representando cerca de 1% do genoma humano. Posteriormente restringimos a nossa busca a PRIS formados por núcleos com menos de 4 kb de comprimento e, portanto, que podem ser amplificados eficientemente por metodologias padrão de PCR (n = 24,001; Fig. 2 B), seguido por um critério adicional de busca arbitrária em que a distância que separa os núcleos correspondentes de um PRIS era entre 4 kb e 100 kb (n = 1,442; Fig. 2 C). A distribuição genómica deste conjunto de PRIS é mostrada na Fig. 3.Fig. 2., via de fluxo de trabalho Bioinformático para selecionar regiões apropriadas para estudar a dinâmica do genoma humano pela PCR. Diferentes passos da via de fluxo de trabalho, como descrito no texto. As zonas cinzentas escuras representam núcleos a e b idênticos de cada região. As zonas cinzentas claras representam regiões homólogas adjacentes a núcleos idênticos. As zonas negras representam repetições comuns do genoma humano. As zonas brancas representam segmentos de DNA que podem ser usados para projetar os correspondentes iniciadores PCR. As setas tracejadas representam ADN presente entre os núcleos idênticos da região correspondente., Linhas pretas representam a posição dos primers: Fa, forward primer(s) de região a; Ra, reverse primer(s) de uma região; Fb, forward primer(s) de região b; Rb, reverse primer(s) de região b. As restrições impostas em diferentes etapas são indicadas na primeira etapa, em que foram introduzidas (ver Resultados). Os números de PRIS restantes após as diferentes restrições impostas são indicados entre parênteses; a partir do passo F, dos 35 PRIS restantes apenas 10 foram analisados (ver resultados).

para conceber iniciadores adequados que flanqueiem os dois núcleos das PRIS correspondentes, é imperiosa a presença de zonas de sequência de ADN “única” a montante e a jusante de cada núcleo. Referimo-nos Aqui a uma sequência de ADN “única” em comparação com as fronteiras correspondentes de cada núcleo da PRIS e não a todo o genoma., É importante ressaltar que a maioria dos núcleos estão realmente imersos em grandes regiões homólogas apresentando alta identidade, geralmente referidas como duplicações segmentais (22). Determinamos o grau de identidade da sequência nas regiões adjacentes aos núcleos correspondentes de cada um dos PRIS por alinhamento global (ver materiais e métodos) da sequência de DNA de cada núcleo estendido 2 kb a montante e 2 kb a jusante. A análise dos 1.442 alinhamentos determinou que apenas 76 PRIS contêm zonas de sequência de DNA” única ” (Fig. 2 D).,

além disso, a presença de sequências de ADN reiteradas noutras localizações do genoma pode prejudicar o desempenho dos iniciadores de PCR correspondentes. Os elementos reiterados mais proeminentes do genoma humano são as chamadas repetições comuns. Estas repetições incluem repetições tandem simples e de baixa complexidade, tais como microssatélites e minissatélites, elementos nucleares curtos e longos intercalados, transposons de DNA, ribossômicos e RNAs de transferência, entre outros. A presença de repetições comuns nas fronteiras de cada núcleo das 75 PRIS foi determinada (ver materiais e métodos)., Apenas aqueles que apresentam pelo menos 200 bp de sequência de DNA “única” sem repetições comuns em ambas as bordas de cada PRIS foram selecionados. Esta selecção resultou num conjunto de 35 PRIS exequíveis (Fig. 2 E).,

Em resumo, de acordo com as diferentes restrições impostas no presente estudo, cada viável PRIS é formado por dois núcleos, a e b, de intrachromosomal invertido sequências de DNA de compartilhamento de 100% de identidade, com um tamanho variando de 400 a 4.000 nucleotídeos, situado a uma distância entre 4 kb e 100 kb, e apresentação de, pelo menos, 200 bp de sequência única nas zonas localizado a 2 kb a montante e a 2 kb jusante de cada núcleo (ver esquema na Fig. 2 E). Este conjunto funcional de PRIS é distribuído entre a maioria dos cromossomas e é destacado na Fig., 3; as localizações dos núcleos de cada PRIS, seus tamanhos e a distância entre eles estão listados no quadro de informações de apoio (SI) 1.

Design de iniciadores válidos para analisar a dinâmica do genoma.

deste conjunto de PRIS viáveis, arbitrariamente selecionamos 10 para projetar os iniciadores PCR. A partir de nossa experiência usando o método PCR para detectar rearranjos em genomas bacterianos, percebemos que é importante projetar e testar vários iniciadores PCR flanqueando cada uma das seqüências repetidas selecionadas (24)., Assim, quatro iniciadores dianteiros foram projetados na região a montante e quatro iniciadores inversos foram projetados na região a jusante dos dois núcleos, a e b, de cada um dos PRIS selecionados. O desenho de cada iniciador incluiu a análise dos seus potenciais locais de primagem em todo o genoma e a sua capacidade de gerar produtos PCR em silício, quando combinado com outros potenciais iniciadores (ver materiais e métodos). Todos os iniciadores selecionados como em silico-valid eram altamente específicos para detectar sua região genômica correspondente., Além disso, quando combinados para detectar o rearranjo de inversão correspondente, não foram comunicados Produtos in silico.

a partir dos 10 PRIS seleccionados, poderíamos desenhar em iniciadores de PCR sílica válidos para 8 deles (Fig. 2 F). Os 32 iniciadores PCR correspondentes de cada um dos oito PRIS selecionados foram sintetizados e testados experimentalmente. As 16 combinações de oligonucleótidos para detectar cada um dos núcleos do conjunto de oito PRIS na configuração de tipo selvagem foram usadas para primar PCRs usando uma amostra de DNA derivada de células sanguíneas como alvo., Só foram aceites os iniciadores que produziam um único produto PCR do tamanho esperado. Se os géis de electroforese para detectar os produtos PCR foram sobrecarregados, então, em alguns casos, foram observadas bandas secundárias fracas; esta situação foi considerada aceitável. A partir dos produtos PCR aceitáveis, inferimos os iniciadores PCR válidos.

para a análise dos pontos de paragem da inversão, usamos o conjunto de oito PRIS com iniciadores PCR válidos. Cada PRIS neste conjunto tinha pelo menos dois dianteiros válidos e dois iniciadores invertidos válidos para cada núcleo (Fig. 2 G)., Todas as combinações de iniciadores válidos foram usadas para procurar os pontos de paragem da inversão em cada PRIS. É importante ressaltar que, em contraste com as reações que detectam as estruturas de tipo selvagem, os PCRs primários para detectar o rearranjo de inversão geralmente não produzem bandas visíveis depois de manchar os géis com brometo de etídio (ver abaixo). Este resultado era esperado, porque se espera que o número de células contendo o rearranjo direcionado seja altamente diluído na amostra a ser testada., Assim, as PCRs secundárias, geralmente aninhadas ou heminizadas, foram realizadas usando uma alíquota do produto da reação primária e todas as possíveis combinações de primers apropriados. Potencial evidência para um rearranjo (Fig. 2 H) foi considerada quando a combinação apropriada de iniciadores produziu um produto PCR do tamanho esperado do fragmento rearranjado e sem faixas secundárias. A partir dos oito PRIS analisados, em seis casos, tivemos evidências claras de rearranjos de inversão., Para determinar se o produto PCR era um fragmento recombinante contendo as regiões correspondentes adjacentes ao núcleo a numa extremidade e ao núcleo b na outra extremidade (ver acima e Fig. 1), a sequência nucleotídica das fronteiras dos produtos PCR foi obtida. Os fragmentos selecionados apresentavam uma sequência de DNA que correspondia à região invertida esperada. Em alguns casos, detectamos pequenos desvios da sequência de referência que devem corresponder a SNPs ou mutações (dados não apresentados)., Os seis PRIS que mostraram evidência de rearranjo de inversão correspondem aos números 5, 6, 7, 13, 22, e 27 na SI Tabela 1. Cinco deles estão localizados dentro de genes humanos conhecidos; em dois casos, os núcleos correspondentes se sobrepõem com exons (PRIS 22 e 27), enquanto nos outros três, ambos os núcleos estão contidos dentro do mesmo intrão (PRIS 5, 6 e 13).montagem de Conjuntos de rearranjo.

para outras experiências, seleccionámos o PRIS 27, localizado no cromossoma 19; O PRIS 22, localizado no cromossoma 15; e o PRIS 6, localizado no cromossoma 3., Estes PRIS serão aqui denotados como região invertida 1 (IR-1), 2 (IR-2), e 3 (IR-3), respectivamente, e são indicados na Fig. 3. Para cada região, preparamos um conjunto de iniciadores que constituem um “kit de rearranjo” (RKit) (SI Tabela 2). Cada RKit é composto por todos os iniciadores de PCR necessários para executar as PCRs primárias e secundárias para detectar as seguintes estruturas específicas de cada região selecionada: o núcleo a, o núcleo b e a estrutura recombinante derivada da inversão., Outro reagente de cada RKit contém um par de iniciadores para obter um fragmento PCR da sequência idêntica correspondente aos núcleos; Quando marcado com radioatividade, este fragmento pode ser usado como uma sonda de hibridação para detectar qualquer um dos produtos PCR correspondentes à região específica.

Como mencionado acima, para validar os fragmentos correspondentes aos rearranjos de inversão, foi determinada a sequência nucleotídica das bordas dos produtos de PCR correspondentes., Os produtos PCR obtidos com os primários específicos incluídos nos RKits correspondentes das regiões IR-1, IR-2 e IR-3 foram validados novamente. Cada produto PCR foi clonado, e as bordas das inserções de três plasmídeos recombinantes, que em todos os casos mostraram o tamanho do fragmento de DNA esperado, foram sequenciadas (ver materiais e métodos)., Para todos os RKits utilizados neste estudo, a sequência nucleotídica do produto PCR e a inserção dos clones derivados do mesmo determinaram a presença dos limites esperados dos breakpoints derivados do rearranjo de inversão correspondente. Os reagentes dos Rcits são apresentados na tabela SI 2. Figura um exemplo dos produtos PCR que representam as diferentes estruturas de cada uma das regiões seleccionadas do genoma. 4.Fig. 4.

Detecção de estruturas de tipo selvagem e rearranjadas por PCR., O ADN humano total isolado a partir de células sanguíneas de um adulto (ver materiais e métodos) foi utilizado como alvo para a PCR preparada com os oligonucleótidos indicados na tabela 2 do SI para os Rcit correspondentes às regiões IR-1 (Esquerda), IR-2 (Centro) e IR-3 (direita). (Superior) são apresentados os produtos PCR manchados com brometo de etídio. (Inferior) são mostradas as autoradiografias das bolhas do Sul dos géis mostradas nas blots superiores hibridizadas com a sonda correspondente para cada região., A, PCRs correspondentes ao núcleo a; B, PCRs correspondentes ao núcleo b; C, PCRs correspondentes à estrutura formada pelo rearranjo de inversão. A migração dos produtos PCR corresponde às suas dimensões previstas em bp, que são as seguintes: : 2,603; 2,845; 2,876; 2,070; 2,885; 2,694; 3,344; 2,894; e 2806 da esquerda para a direita.

características das regiões seleccionadas para detectar rearranjos genómicos.

as regiões selecionadas para analisar a ocorrência de rearranjos genômicos são esquematizadas na figura. 5., Tanto a estrutura de tipo selvagem como a derivada de uma inversão devida à NAHR dos núcleos idênticos correspondentes são mostradas.Fig. 5. características das regiões analisadas para detectar rearranjos de inversão no genoma humano. A) estrutura de tipo selvagem da IR-1. B) estrutura invertida da IR-1. C) estrutura de tipo selvagem da IR-2. D) estrutura invertida da IR-2. E) estrutura de tipo selvagem da IR-3. F) estrutura invertida da IR-3. As linhas sólidas horizontais correspondem aos genes que abrigam os núcleos que participam no rearranjo; as zonas sólidas verticais correspondem aos exons de tais genes., Em IR – 1 e IR-2 onde dois genes homólogos, SAFB2/SAFB e DUOX2/DUOX1, respectivamente, participam no rearranjo, um gene é mostrado em vermelho e outro em azul. In IR-3, The gene where the rearranjo is localized is shown in gray. As setas verdes indicam o local de iniciação e a direção da transcrição de cada gene. As linhas pontilhadas representam DNA entre ou fora dos genes envolvidos nos rearranjos. Os núcleos idênticos de cada região são representados como retângulos., A escala de tamanho é diferente para cada região e é expandida nos núcleos idênticos; o tamanho de cada núcleo é indicado acima de uma seta sólida que mostra a orientação relativa de cada núcleo. O resto da escala é semelhante para as várias estruturas presentes, mas é diferente para cada região. As escalas podem ser inferidas a partir do tamanho do segmento de DNA entre os núcleos idênticos em cada região; 36.924; 24.128; e 7.935 bp para IR-1, IR-2 e IR-3, respectivamente. No IR-2, está indicada a presença de NIP genético na região entre os genes DUOX2 e DUOX1.,

os núcleos a e b idênticos da região IR-1 são fragmentos de ADN de 941 bp separados por 36.925 bp. O núcleo A contém exon 7 e parte dos intrões 6-7 e 7-8 do gene SAFB2; o núcleo b contém exon 7 e parte dos intrões 6-7 e 7-8 do gene SAFB (Fig. 5 A). Os Genes SAFB2 e SAFB são genes paralógicos transcritos na direção oposta. A função destes genes tem sido proposta para estar envolvida na organização cromatina, regulação transcritional, splicing RNA e resposta ao estresse (27). Como mostrado na Fig., 5 B, um rearranjo de inversão derivado de NAHR mediado pelos dois núcleos idênticos alteraria a estrutura dos dois genes.na região IR-2, Os núcleos idênticos são extensões de ADN de 482 bp separadas por 24.129 bp. O núcleo a inclui o exon 7 e parte do exon 6, bem como o intron 6-7 e parte do intron 7-8 do gene DUOX2 (Fig. 5 C). O núcleo b inclui o exon 8 e parte do exon 7, bem como o intron 7-8 e parte do intron 8-9 do gene DUOX1 (Fig. 5 C). Estes genes foram anotados como oxidases do NADPH e revelaram-se altamente expressos nas células da tiróide (28)., Na região entre os genes DUOX2 e DUOX1, outro gene, NIP, está localizado. Como no caso de SAFB2 e SAFB, os genes DUOX2 e DUOX1 são genes paralógicos transcritos na direção oposta. Consequentemente, a inversão mediada por NAHR dos dois núcleos idênticos (Fig. 5 D) alteraria a estrutura dos genes.

no caso da região IR-3, Os núcleos idênticos são segmentos de ADN de 885 bp separados por 7.935 bp. Ambos são parte de uma estrutura comum de repetição, uma longa repetição terminal, e estão localizados no mesmo intrão, intron 3, do gene RNF13(Fig. 5 E)., Este gene foi anotado como uma proteína do dedo anelar de zinco; a sua função específica não foi determinada. A inversão resultante de NAHR entre os dois núcleos (Fig. 5 F) resultaria em uma pequena alteração da estrutura genética, localizada dentro do intron 3, e presumivelmente não teria relevância fisiológica.

cinética de tempo da detecção de rearranjos por PCR.

usando os reagentes de um RKit, as PCRs foram realizadas para detectar estruturas de tipo selvagem ou rearranjadas. Tanto reações primárias quanto secundárias foram realizadas, e alíquotas foram analisadas em ciclos diferentes., As alíquotas foram submetidas a eletroforese em gel de agarose e reveladas por ambas as manchas de brometo de etídio e por blots do Sul hibridizadas contra uma sonda radioativa. Um exemplo de Utilização da região IR-1 e um ADN-alvo das células sanguíneas é apresentado na Fig. 6.Fig. 6. cinética de tempo da PCR para detectar estruturas de tipo selvagem e invertidas. Foi utilizada como alvo para a PCR uma amostra de ADN de 100 ng de células sanguíneas de um indivíduo adulto., As reacções foram preparadas com os oligonucleótidos para detectar a estrutura de tipo selvagem do núcleo A (A E B) e da estrutura invertida (C E D) da região IR-1 (conforme indicado na tabela SI 2). Reacção primária PCR. Reacção secundária da PCR. Foram tomadas alíquotas a cada 3 ciclos, do ciclo 3 ao ciclo 30. Os produtos PCR foram revelados com brometo de etídio (A E C) ou por blots do Sul hibridizados com a sonda correspondente (B E D).,

na PCR revelando a estrutura de tipo selvagem, a coloração do brometo de etídio mostrou o fragmento esperado desde a reacção primária (Fig. 6 a), enquanto que a estrutura correspondente ao ponto de ruptura do rearranjo de inversão foi revelada apenas até a reação secundária, neste caso aninhada (Fig. 6 C). Usando blots do Sul, poderíamos demonstrar que o fragmento revelando o ponto de ruptura da estrutura rearranjado está realmente sendo produzido na reação primária (Fig. 6 D).,a cinética Temporal da PCR pode ser utilizada como método semiquantitativo para estimar a proporção relativa de estruturas rearranjadas em comparação com estruturas de tipo selvagem. No entanto, esta técnica é apenas uma aproximação, uma vez que a duplicação do produto PCR em cada ciclo é geralmente obtida no caso de pequenos produtos e em determinadas condições específicas, tais como as utilizadas para a PCR quantitativa. Para quantificar a proporção relativa de rearranjos numa amostra de ADN, decidimos utilizar um método mais fiável baseado na diluição do ADN-alvo (ver abaixo).,cinética de diluição da detecção de rearranjos por PCR.

quando o ADN-alvo de uma PCR é diluído e a reacção é preparada para detectar uma estrutura de tipo selvagem, é atingida uma diluição em que não se encontra nenhum produto. Esta diluição deve estar próxima de uma concentração de ADN-alvo de aproximadamente um genoma haplóide por reacção. Em contrapartida, se a reacção for preparada para detectar um rearranjo, a diluição em que nenhum produto é encontrado deve ser proporcional à concentração relativa do rearranjo respectivo na amostra de ADN. Uma experiência típica é apresentada na Fig., 7 usando uma amostra de ADN das células sanguíneas como alvo. A estrutura de tipo selvagem correspondente ao núcleo a da região IR-1 deu PCRs positivos até uma diluição contendo ≈10 pg de ADN por reacção; a uma concentração de 3 pg por reacção, teoricamente ligeiramente inferior a um genoma haplóide por reacção, não foi observado nenhum produto PCR (Fig. 7 A). Em contraste, quando a PCR foi preparada para detectar o ponto de ruptura da inversão, a reação contendo ≈3 ng ainda era positiva, enquanto as reações contendo 1 ng ou menos eram todas negativas (Fig. 7 B).Fig. 7., cinética de diluição

para detectar estruturas de tipo selvagem e invertidas. Uma amostra de ADN de células sanguíneas de um indivíduo adulto foi utilizada como alvo para a PCR. A PCR foi preparada com os oligonucleótidos para detectar a estrutura de tipo selvagem do núcleo a (A) e a estrutura invertida (B-D) do IR–1 (conforme indicado no quadro SI 2). Os produtos PCR foram revelados pelo brometo de etídio após a electroforese em gel. (A e B) foram utilizadas diferentes quantidades de ADN: 1, 100 ng; 2, 33 ng; 3, 10 ng; 4, 3 ng; 5, 1 ng; 6, 333 pg; 7, 100 pg; 8, 33 pg; 9, 10 pg, 10, 3 pg., C E D) foram utilizadas vinte e quatro alíquotas diferentes contendo 3 ng (c) ou 1 ng (D) de ADN para detectar a estrutura invertida.

é importante notar que, como esperado, nas diluições que apresentam a última reacção positiva ou a primeira reacção negativa, algumas alíquotas apresentam reacções positivas e algumas negativas. Este achado é ilustrado na Fig. 7 C E D para as PCRs que detectam o rearranjo de inversão. A partir de 24 alíquotas da diluição contendo 3 ng de ADN-alvo por reacção, 17 foram positivas(Fig. 7 C)., Na diluição seguinte, contendo 1 ng de ADN-alvo por reacção, de 24 alíquotas apenas 3 deram reacções positivas(Fig. 7 D). Em diluições contendo 18 ng ou mais alvo de DNA por reação, todas as alíquotas deu uma reação positiva, enquanto que em diluições contendo <1 ng, todas as alíquotas deu reacções negativas (dados não mostrados)., A concentração relativa de ADN necessária para produzir uma reacção positiva detectando o rearranjo, em comparação com a necessária para produzir uma reacção positiva detectando a estrutura de tipo selvagem, é proporcional à concentração relativa de estruturas de tipo rearranjado vs. selvagem no ADN-alvo.concentração relativa de estruturas reorganizadas em diferentes amostras de ADN derivadas de células somáticas.

a estratégia de diluição exemplificada acima foi utilizada para detectar a concentração relativa dos pontos de paragem do rearranjo em amostras de ADN de indivíduos independentes., O ADN foi extraído de células sanguíneas de recém-nascidos (sangue do cordão umbilical) ou de indivíduos adultos (Ver materiais e métodos). Para cada amostra de DNA, várias alíquotas de diferentes diluições foram usadas como alvos para PCRs para detectar tanto o tipo selvagem (núcleo a) quanto a estrutura rearranjada correspondente derivada de eventos de inversão das regiões IR-1, IR-2 e IR-3. Várias alíquotas de diluições apropriadas foram usadas, e a concentração relativa de DNA alvo para produzir uma reação positiva detectando o tipo selvagem ou a estrutura rearranjada correspondente foi calculada., A razão entre a concentração de estruturas de tipo selvagem e as estruturas reorganizadas das diferentes DNAs-alvo é apresentada numa escala logarítmica na Fig. 8.Fig. 8. concentração relativa de estruturas de tipo selvagem e invertidas em amostras de ADN isoladas de diferentes indivíduos não relacionados. O ADN isolado de células sanguíneas de diferentes indivíduos foi utilizado como alvo para a PCR. A reação foi preparada com os oligonucleótidos indicados na tabela 2 do SI para detectar os núcleos a ou as estruturas invertidas de IR-1, IR-2 e IR-3., A quantidade de estruturas de tipo selvagem e invertidas foi determinada através da análise de várias alíquotas de amostras contendo diferentes quantidades de DNA (ver resultados). A quantidade relativa de estruturas de tipo selvagem para estruturas invertidas é indicada numa escala logarítmica. 1-4, DNA samples from four different adult individuals; 5-8, DNA samples from umbilical cord blood of four different newborns (see Materials and Methods); a, mean value for DNA from adult individuals; B, mean value for DNA from newborn individuals.,

os oito indivíduos testados apresentaram rearranjos de inversão nas três regiões analisadas. No entanto, a concentração relativa dos rearranjos variou tanto entre amostras como entre regiões. Nos extremos, uma amostra recém-nascida de DNA apresentou cerca de 105 estruturas de tipo selvagem por uma estrutura invertida na região IR – 1 (indivíduo 6), enquanto algumas amostras adultas apresentaram aproximadamente duas estruturas de tipo selvagem por uma estrutura invertida na região IR-3 (indivíduos 1 e 3)., Em todas as amostras, a região IR-3 apresentou uma maior concentração relativa de estruturas reorganizadas do que as regiões IR-1 e IR-2. A descoberta mais marcante foi que, para as três regiões analisadas, o DNA isolado no momento do nascimento continha uma concentração significativamente menor de estruturas rearranjadas do que a isolada de indivíduos adultos. A diferença dos valores médios entre os dois grupos foi significativa para as três regiões, IV-1 (P < 0.02), IV-2 (P < 0,001), e IV-3 (P < 0.,001), utilizando uma análise unidireccional da variância. O rácio dos valores médios entre ambos os grupos foi 17-, 70-e 166-vezes para as regiões IR-1, IR-2 e IR-3, respectivamente.