T4 DNA Ligase: a única Ligase que você vai precisar?

ligases de ADN, incluindo a ferramenta de biologia molecular T4 DNA ligase, são enzimas que facilitam a junção de cadeias de ADN catalisando a formação da ligação fosfodiester entre grupos 5′-PO4 e 3′-OH da coluna vertebral do ADN. Nos organismos, a ligase do DNA desempenha um papel importante na reparação de quebras no DNA introduzidas durante a replicação e dano, garantindo assim a integridade da informação genética.,

the Discovery of DNA Ligases

Given their vital roles in DNA repair and replication, DNA ligase activity in cells was proposed to exist even before their discovery. Duas observações estimularam a busca por ligases de ADN.a ocorrência de recombinação genética por ruptura e re-união de moléculas de ADN.a formação de círculos fechados por ADN linear a partir do bacteriófago I após a infecção.em 1967, ligases de DNA foram descobertas independentemente pelos laboratórios Gellert, Lehman, Richardson e Hurwitz., Desde a sua descoberta, os ligases de ADN tornaram-se ferramentas importantes na biologia molecular. Ligases de DNA são usadas na clonagem molecular para unir fragmentos de DNA para criar DNA recombinante, como quando um pedaço de DNA estranho é inserido em um plasmídeo.

A maioria das reações de ligação envolve fragmentos de DNA que foram gerados a partir de digestos de restrição, com extremidades coesas ou contundentes., A ligação é geralmente realizada como uma reação separada após a restrição digestão, embora alguns protocolos descrevem um método de clonagem de um tubo PCR onde a restrição digestão e ligação são permitidos ocorrer simultaneamente na mesma reação.ligase de ADN T4: a única Ligase de que alguma vez precisarás?

T4 DNA ligase é a ligase mais usada em biologia molecular. Como seus parentes, T3 e T7 ligases, é nomeado em homenagem ao bacteriófago do qual foi identificado pela primeira vez. É uma ligase de DNA dependente de ATP porque hidrolisa ATP durante a ligação covalente dos grupos 5′-PO4 e 3′-OH.,

Este ligase versátil é recomendado para a maioria das aplicações rotineiras de clonagem molecular, pois pode ligar tanto fragmentos de DNA de ponta dupla e coeso (geralmente entre um vetor plasmídeo e inserção), bem como T/a clonagem.devido à versatilidade da ligase de DNA T4 em ligamentos coesos e extremidades contundentes, ela foi otimizada para uma série de condições para ligação rápida e eficiente. Algumas variantes da ligase de DNA T4 foram projetadas para suportar sal e altas temperaturas até 50 ° C., Tais ligases de DNA são úteis para reações de ligação com altas concentrações de sal ou temperaturas elevadas. A realização da ligação a temperaturas mais elevadas reduz o tempo de incubação e aumenta a especificidade da ligação. T4 DNA ligase também tem sido usado para ligação rápida, em que a reação ocorre em 5 minutos à temperatura ambiente em vez de durante a noite a 16°C, usando um tampão especialmente otimizado que aumenta a eficiência da ligação. Escolha um ligase de DNA rápido se você está com pressa!então, a ligase de ADN T4 é a única ligase de que alguma vez precisarás?, Bem, enquanto ele executa muitas das aplicações padrão de ligases de DNA no laboratório, ele tem algumas desvantagens.

não é particularmente tolerante ao sal

a actividade dos ligases de ADN T4 começa a diminuir rapidamente quando as concentrações de sal excedem 200 mM, por isso, se as condições para a sua ligação envolverem níveis elevados de sal (por exemplo, quando o transporte de sal é um problema de passos anteriores), pode experimentar problemas e seria melhor escolher uma ligase alternativa.Por sorte, outras opções estão disponíveis., T3 DNA ligase, que também pode ligar ambos os fragmentos de DNA contundente e pegajoso, pode tolerar concentrações de sal de até 250-300 mM. no entanto, esta não é a sua única opção. Variantes de ligase T4 que podem suportar concentrações de sal de até 500 mM foram criadas, tais como a Ligase DNA Salt-T4.embora isto inicialmente possa não parecer um problema, pode haver momentos em que você tem tanto o DNA coeso e contundente em uma reação e você só quer ligar as extremidades coesas., Nesta situação, a ligase de ADN T7 é tua amiga, pois não liga as extremidades rombas.

E. coli DNA ligase é outra escolha neste cenário. Esta ligase não liga extremidades contundentes e tem uma maior afinidade para extremidades coesas do que a ligase T4. A ligase ADN de E. coli é uma ligase nad+ dependente, por isso o tampão que usa será diferente da ligase T4.

It Can Ligate Mismatches in Nicks

T4 DNA ligase is a very active ligase, and while in general DNA ligases prefer to ligate fully Watson-Crick base-pair DNA, T4 ligase can ligate mismatches in DNA nicks., Se a ligação de alta fidelidade do ADN cortado é o teu objectivo, então a ligase de ADN Taq dependente da nad+ é a ferramenta para o trabalho.

A ligase de ADN Taq termoestável também está activa a temperaturas mais elevadas (37-75oC). A capacidade de efectuar ligações a temperaturas elevadas e a maior fidelidade dos ligases de ADN Taq reduz a incidência de ADN recombinante não correspondido. Mas note que esta enzima só pode ligar cortes e não pontas grossas ou coesas.,

a ligadura seletiva de nicks por ligase de DNA Taq faz dela a solução perfeita para técnicas onde apenas nicks devem ser ligadas e a ligação final precisa ser suprimida, tais como alguns métodos de montagem de DNA. Existem numerosas aplicações que utilizam a ligação de alta fidelidade de nicks por ligase de DNA Taq, incluindo para detecção e quantificação de polimorfismos de nucleótidos únicos.

Overview of Ligase Applications

While T4 DNA ligase may be the ligase of choice for many molecular biology applications, it isn’t always the best ligase for the job., Para uma rápida visão geral das características dos diferentes ligases, consulte a nossa tabela de pesquisa rápida abaixo.

Keeping the above points in mind, it shouldn’t be difficult to choose a DNA ligase for your next ligation application!, Usa outro ligase que não o T4? Deixe um comentário abaixo.

Leitura Adicional

Ligase de ADN, T4. In Worthington Enzyme Manual. Worthington Biochemical Corporation. (2019).

Shuman, S. Ligases DNA: Progress and Prospects. JBC. 284(26);17365–9 (2009). DOI 10.1074 / jbc.R900017200

substrato-based Ligase Selection Chart. Biolabs De Nova Inglaterra.

DNA Ligase Selection Chart. Biolabs De Nova Inglaterra.Lehnman, I. R.. Ligase de ADN: estrutura, mecanismo e função. Ciência, 186(4166);790-797 (1974). DOI: 10.1126 / science.186.4166.,790

substrato especificidade e desconexão discriminação nos ligases do ADN. New England Biolabs