Récurrent de l’ADN inversion des réarrangements du génome humain

Résultats

la Justification de l’Analyse du Génome Humain Dynamique.

pour étudier la dynamique du génome humain, nous avons ciblé la détection de points d’arrêt de réarrangement chromosomique. Cela nécessite la disponibilité d’une séquence génomique de référence de très haute qualité. La séquence actuelle du génome humain répond à ces normes de qualité, contenant peu de lacunes avec un taux d’erreur estimé très faible (26)., Pour cette étude, la version Build 36 du National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la séquence génomique de référence humaine a été utilisée.

pour identifier les sites potentiels de NAHR, la séquence du génome humain de référence a d’abord été analysée afin de trouver des régions chromosomiques à forte identité de séquence. Si un événement de recombinaison à médiation NAHR devait se produire, de nouvelles structures génomiques devraient être formées., De plus, si ces événements se produisaient dans des cellules somatiques, alors ces nouvelles structures génomiques seraient prévues pour être présentes dans une très petite fraction du total des cellules analysées, la grande majorité des cellules contenant la structure génomique non modifiée correspondante (ici appelée structures de type sauvage). Des preuves de cela peuvent être trouvées dans d’autres organismes, tels que les bactéries (24, 25). Par conséquent, pour identifier de tels réarrangements chromosomiques, une procédure expérimentale très sensible et spécifique est nécessaire., À notre avis, à l’heure actuelle, la technique de choix pour ce type d’étude serait une analyse par PCR utilisant des amorces d’oligonucléotides correctement définies.

La présente étude se concentre sur les inversions D’ADN dérivées d’événements NAHR entre des paires de séquences répétées situées en orientation inverse qui peuvent générer des inversions D’ADN. Le schéma présenté à la Fig. 1 A illustre une paire de structures de type wild, notées a et b, et le réarrangement d’inversion correspondant qui peut être produit par NAHR (fig. 1 B), ainsi que les amorces de PCR nécessaires pour détecter les différentes structures., Les amorces doivent correspondre à des régions proximales, bien qu’externes, aux répétitions. Si des amorces avant et arrière flanquant l’une des répétitions sont utilisées pour le test PCR, la structure de type sauvage correspondante est détectée (Fig. 1 A). Un point d’arrêt d’inversion peut être détecté en utilisant les deux amorces avant (Fa et Fb) ou les deux amorces arrière (Ra et Rb) (Fig. 1 B). Selon la position des amorces correspondantes dans la séquence nucléotidique, la taille exacte du fragment PCR attendu peut être calculée.

Sélection de Séquences Répétées d’Analyser le Génome de la Dynamique.

les régions génomiques à étudier ont été sélectionnées par une procédure bioinformatique en plusieurs étapes schématisée à la Fig. 2., La première étape a consisté à identifier toutes les paires de séquences inversées intrachromosomiques formées par deux noyaux, a et b, d’au moins 400 nucléotides de longueur partageant 100% d’identité de séquence (voir matériaux et méthodes). Ces paires de séquences sont ici appelées séquences inversées recombinogènes potentielles (PRIS) (Fig. 2 A). Un total de 24,547 PRIS ont été trouvés dans la construction NCBI 36 du génome humain de référence. Les PRIS sont répartis entre les 24 chromosomes différents, et les noyaux comprenant ces PRIS ont varié en longueur de 400 à 74 868 nucléotides., Le nombre total de nucléotides présents dans les PRI non redondants était de 31 115 694 bp, ce qui représente ≈1% du génome humain. Par la suite, nous avons limité notre recherche aux PRI formés par des noyaux de longueur inférieure à 4 Ko et, par conséquent, qui pourraient être amplifiés efficacement par des méthodologies PCR standard (n = 24,001; Fig. 2 B), suivie d’un critère de recherche arbitraire supplémentaire selon lequel la distance séparant les noyaux correspondants d’un PRIS était comprise entre 4 Ko et 100 Ko (n = 1 442; Fig. 2 C). La distribution génomique de cet ensemble de PRI est illustrée à la Fig. 3.

pour concevoir des amorces appropriées flanquant les deux noyaux des PRI correspondants, la présence de zones de séquence D’ADN « unique” en amont et en aval de chaque noyau est impérative. Nous nous référons ici à une séquence D’ADN « unique » par rapport aux frontières correspondantes de chaque noyau du PRI et non au génome entier., Il est important de souligner que la plupart des noyaux sont en fait immergés dans des régions homologues plus grandes présentant une identité élevée, généralement appelées duplications segmentaires (22). Nous avons déterminé le degré d’identité de séquence dans les régions adjacentes aux noyaux correspondants de chacun des PRI par alignement global (voir matériaux et méthodes) de la séquence D’ADN de chaque noyau étendu 2 kb en amont et 2 kb en aval. L’analyse des 1 442 alignements a permis de déterminer que seulement 76 PI contiennent des zones de séquence D’ADN « unique” (Fig. 2 D).,

de plus, la présence de séquences D’ADN réitérées à d’autres endroits du génome pourrait altérer les performances des amorces PCR correspondantes. Les éléments réitérés les plus importants du génome humain sont les répétitions dites communes. Ces répétitions comprennent des répétitions tandem simples et de faible complexité, telles que des microsatellites et des minisatellites, des éléments nucléaires intercalés courts et longs, des transposons D’ADN et des ARN ribosomiques et de transfert, entre autres. La présence de répétitions communes dans les bordures de chaque noyau des 75 PRI a été déterminée (voir matériaux et méthodes)., Seuls ceux présentant au moins 200 pb de séquence D’ADN « unique” dépourvue de répétitions communes dans les deux bordures de chaque PRI ont été sélectionnés. Cette sélection a abouti à un ensemble de 35 PRIS réalisables (fig. 2 E).,

En résumé, selon les différentes restrictions imposées dans la présente étude, chaque PRI réalisable est formé de deux noyaux, a et b, de séquences d’ADN inversé intrachromosomiques partageant 100% d’identité, avec une taille allant de 400 à 4 000 nucléotides, situés à une distance comprise entre 4 kb et 100 kb, et présentant au moins 200 bp de séquence unique dans les zones situées à 2 kb en amont et 2 kb en aval de chaque noyau (voir Schéma sur la Fig. 2 E). Cet ensemble réalisable de PRI est réparti entre la plupart des chromosomes et est mis en évidence sur la Fig., 3; Les Emplacements des noyaux de chaque PRIS, leurs tailles et la distance entre eux sont énumérés dans les informations à l’appui (SI) Tableau 1.

conception d’Amorces valides pour analyser la dynamique du génome.

à partir de cet ensemble de PRI réalisables, nous avons arbitrairement sélectionné 10 pour concevoir des amorces PCR. De notre expérience en utilisant la méthode PCR pour détecter les réarrangements dans les génomes bactériens, nous avons réalisé qu’il est important de concevoir et de tester plusieurs amorces PCR flanquant chacune des séquences répétées sélectionnées (24)., En conséquence, quatre amorces avant ont été conçues dans la région amont et quatre amorces arrière ont été conçues dans la région aval des deux noyaux, a et b, de chacun des PRI sélectionnés. La conception de chaque amorce comprenait l’analyse de ses sites d’amorçage potentiels dans le génome entier et de sa capacité à générer des produits de PCR in silico lorsqu’ils sont combinés avec d’autres amorces potentielles (voir matériaux et méthodes). Toutes les amorces sélectionnées comme in silico-valides étaient hautement spécifiques pour détecter la région génomique correspondante., De plus, lorsqu’ils sont combinés pour détecter le réarrangement d’inversion correspondant, aucun produit in silico n’a été signalé.

parmi les 10 PRI sélectionnés, nous avons pu concevoir des amorces PCR in silico-valides pour 8 D’entre eux (Fig. 2 F). Les 32 amorces PCR correspondantes de chacun des huit PRI sélectionnés ont été synthétisées et testées expérimentalement. Les 16 combinaisons d’oligonucléotides pour détecter chacun des noyaux de l’ensemble de huit PRI dans la configuration de type sauvage ont été utilisées pour amorcer les PCR en utilisant un échantillon D’ADN dérivé de cellules sanguines comme cible., Seules les amorces produisant un seul produit de PCR de la taille attendue ont été acceptées. Si les gels d’électrophorèse pour détecter les produits de PCR étaient surchargés, alors, dans certains cas, de faibles bandes secondaires ont été observées; cette situation a été jugée acceptable. À partir des produits PCR acceptables, nous avons déduit les amorces PCR valides.

pour l’analyse des points d’arrêt d’inversion, nous avons utilisé l’ensemble de huit PRI avec des amorces PCR valides. Chaque PRI de cet ensemble avait au moins deux amorces avant et deux amorces arrière valides pour chaque noyau (fig. 2 G)., Toutes les combinaisons d’amorces valides ont été utilisées pour rechercher les points d’arrêt d’inversion dans chaque PRI. Il est important de souligner que, contrairement aux réactions détectant les structures de type wild, les PCR primaires pour détecter le réarrangement d’inversion n’ont généralement pas produit de bandes visibles après coloration des gels avec du bromure d’éthidium (voir ci-dessous). Ce résultat était attendu, car le nombre de cellules contenant le réarrangement ciblé devrait être fortement dilué dans l’échantillon testé., Par conséquent, les PCR secondaires, habituellement imbriqués ou héminestés, ont été réalisés en utilisant une aliquote du produit de la réaction primaire et toutes les combinaisons possibles d’amorces appropriées. Preuve potentielle d’un réarrangement (Fig. 2 H) a été considéré lorsque la combinaison appropriée d’amorces a produit un produit PCR de la taille prévue du fragment réarrangé et sans bandes secondaires. Des huit PRI analysés, dans six cas, nous avions des preuves potentielles claires de réarrangements d’inversion., Pour vérifier que le produit PCR était un fragment recombinant contenant les régions correspondantes adjacentes au noyau a à une extrémité et au noyau b à l’autre extrémité (voir ci-dessus et Fig. 1), la séquence nucléotidique des bordures des produits PCR a été obtenue. Les fragments sélectionnés présentaient une séquence D’ADN qui correspondait à celle de la région inversée attendue. Dans certains cas, nous avons détecté des écarts mineurs par rapport à la séquence de référence qui devraient correspondre à des SNP ou à des mutations (données non présentées)., Les six PRI qui ont montré des preuves de réarrangements d’inversion correspondent à des nombres 5, 6, 7, 13, 22, et 27 dans le tableau SI 1. Cinq d’entre eux sont situés dans des gènes humains connus; dans deux cas, les noyaux correspondants se chevauchent avec des exons (PRIS 22 et 27), tandis que dans les trois autres, les deux noyaux sont contenus dans le même intron (PRIS 5, 6 et 13).

assemblage de Kits de réarrangement.

pour d’autres expériences, nous avons sélectionné le PRIS 27, situé sur le chromosome 19; Le PRIS 22, Situé sur le chromosome 15; et le PRIS 6, situé sur le chromosome 3., Ces PRI seront notés ici comme région inversée 1 (IR-1), 2 (IR-2) et 3 (IR-3), respectivement, et sont indiqués sur la Fig. 3. Pour chaque région, nous avons préparé un ensemble d’amorces constituant un « kit de réarrangement” (Rkit) (si Tableau 2). Chaque RKit est composé de toutes les amorces de PCR nécessaires pour effectuer les PCR primaires et secondaires pour détecter les structures spécifiques suivantes de chaque région sélectionnée: le noyau a, le noyau b et la structure recombinante dérivée de l’inversion., Un autre réactif de chaque RKit contient une paire d’amorces pour obtenir un fragment PCR de la séquence identique correspondant aux noyaux; lorsqu’il est marqué avec de la radioactivité, ce fragment peut être utilisé comme sonde d’hybridation pour détecter l’un quelconque des produits PCR correspondant à la région spécifique.

comme mentionné ci-dessus, pour valider les fragments correspondant aux réarrangements d’inversion, la séquence nucléotidique des bordures des produits PCR correspondants a été déterminée., Les produits PCR obtenus avec les amorces spécifiques incluses dans les RKits correspondants des régions IR-1, IR-2 et IR-3 ont été validés. Chaque produit de PCR a été cloné et les bordures des inserts de trois plasmides recombinants, qui dans tous les cas ont montré la taille du fragment d’ADN attendu, ont été séquencées (voir matériaux et méthodes)., Pour tous les Rkit utilisés dans cette étude, la séquence nucléotidique du produit PCR et de l’insertion des clones qui en sont dérivés a permis de vérifier la présence des bordures attendues des points de rupture dérivées du réarrangement d’inversion correspondant. Les réactifs des RKits sont présentés dans le tableau SI 2. Un exemple de produits PCR représentant les différentes structures de chacune des régions sélectionnées du génome est illustré à la Fig. 4.

Caractéristiques des Régions Sélectionnées pour Détecter des Réarrangements Génomiques.

les régions sélectionnées pour analyser l’apparition de réarrangements génomiques sont schématisées à la Fig. 5., La structure de type wild et celle dérivée d’une inversion due à NAHR des noyaux identiques correspondants sont représentées.

Les noyaux identiques a et b de la région IR-1 sont des fragments D’ADN de 941 PB séparés par 36 925 PB. Le noyau a contient l’exon 7 et une partie des introns 6-7 et 7-8 du gène SAFB2; le noyau b contient l’exon 7 et une partie des introns 6-7 et 7-8 du gène SAFB (Fig. 5 A). Les gènes SAFB2 et SAFB sont des gènes paralogues transcrits dans la direction opposée. Il a été proposé que la fonction de ces gènes soit impliquée dans l’organisation de la chromatine, la régulation transcriptionnelle, l’épissage de l’ARN et la réponse au stress (27). Comme indiqué dans la Fig., 5 B, un réarrangement d’inversion dérivé de NAHR médié par les deux noyaux identiques modifierait la structure des deux gènes.

dans la région IR-2, les noyaux identiques sont des étendues D’ADN de 482 PB séparées par 24 129 PB. Le noyau a comprend l’exon 7 et une partie de l’exon 6, ainsi que l’intron 6-7 et une partie de l’intron 7-8 du gène DUOX2 (Fig. 5 C). Le noyau b comprend l’exon 8 et une partie de l’exon 7, ainsi que l’intron 7-8 et une partie de l’intron 8-9 du gène DUOX1 (Fig. 5 C). Ces gènes ont été annotés sous forme de NADPH oxydases et se sont avérés être fortement exprimés dans les cellules thyroïdiennes (28)., Dans la région entre les gènes DUOX2 et DUOX1, un autre gène, NIP, est situé. Comme dans le cas de SAFB2 et SAFB, les gènes DUOX2 et DUOX1 sont des gènes paralogues transcrits dans la direction opposée. En conséquence, l’inversion médiée par NAHR des deux noyaux identiques (Fig. 5 D) modifierait la structure des gènes.

dans le cas de la région IR-3, les noyaux identiques sont des segments D’ADN de 885 PB séparés par 7 935 PB. Les deux font partie d’une structure de répétition commune, une répétition terminale longue, et sont situés dans le même intron, intron 3, du gène RNF13 (Fig. 5 E)., Ce gène a été annoté comme une protéine de doigt de zinc d’anneau; sa fonction spécifique n’a pas été déterminée. L’inversion résultant de NAHR entre les deux noyaux (Fig. 5 F) entraînerait une altération mineure de la structure du gène, située dans l’intron 3, et n’aurait vraisemblablement pas de pertinence physiologique.

cinétique temporelle de la détection des réarrangements par PCR.

En utilisant les réactifs d’un RKit, des PCR ont été effectués pour détecter des structures de type sauvage ou réarrangées. Les réactions primaires et secondaires ont été effectuées, et les aliquotes ont été analysées à différents cycles., Les aliquotes ont été soumises à une électrophorèse sur gel d’agarose et révélées à la fois par une coloration au bromure d’éthidium et par des taches Southern hybridées contre une sonde radioactive. Un exemple utilisant la région IR-1 et un ADN cible provenant de cellules sanguines est présenté à la Fig. 6.

dans la PCR révélant la structure de type sauvage, la coloration au bromure d’éthidium a montré le fragment attendu depuis la réaction primaire (Fig. 6 A), alors que la structure correspondant au point d’arrêt du réarrangement d’inversion n’a été révélée que jusqu’à la réaction secondaire, en l’occurrence imbriquée (fig. 6 C). En utilisant Southern blots, nous avons pu démontrer que le fragment révélant le point d’arrêt de la structure réarrangée est en fait produit dans la réaction primaire (Fig. 6 D).,

la cinétique temporelle de la PCR pourrait être utilisée comme méthode semi-quantitative pour estimer la proportion relative de structures réarrangées par rapport aux structures de type wild. Cependant, cette technique n’est qu’une approximation, car le doublement du produit PCR à chaque cycle est généralement obtenu dans le cas de petits produits et dans certaines conditions spécifiques, telles que celles utilisées pour la PCR quantitative. Pour quantifier la proportion relative des réarrangements dans un échantillon d’ADN, nous avons décidé d’utiliser une méthode plus fiable basée sur la dilution de l’ADN cible (voir ci-dessous).,

cinétique de Dilution de la détection des réarrangements par PCR.

lorsque l’ADN cible pour une PCR est dilué et que la réaction est amorcée pour détecter une structure de type sauvage, une dilution est atteinte dans laquelle aucun produit n’est trouvé. Cette dilution devrait être proche d’une concentration d’ADN cible d’environ un génome haploïde par réaction. En revanche, si la réaction est amorcée pour détecter un réarrangement, alors la dilution à laquelle aucun produit n’est trouvé devrait être proportionnelle à la concentration relative du réarrangement respectif dans l’échantillon d’ADN. Une expérience typique est présentée à la Fig., 7 en utilisant un échantillon D’ADN de cellules sanguines comme cible. La structure de type sauvage correspondant au noyau a de la région IR-1 a donné des PCR positifs jusqu’à une dilution contenant ≈10 pg d’ADN par réaction; à une concentration de 3 pg par réaction, théoriquement légèrement inférieure à un génome haploïde par réaction, aucun produit de PCR n’a été observé (Fig. 7 A). En revanche, lorsque la PCR a été amorcée pour détecter le point de rupture d’inversion, la réaction contenant ≈3 ng était toujours positive, alors que les réactions contenant 1 ng ou moins étaient toutes négatives (Fig. 7 B).

Il est important de noter que, comme prévu, au dilutions présenter les dernières positive ou la première réaction négative, certaines parties aliquotes présent positif et quelques réactions négatives. Cette constatation est illustrée à la Fig. 7 C Et D pour les PCR détectant le réarrangement d’inversion. Sur 24 aliquotes de la dilution contenant 3 ng d’ADN cible par réaction, 17 étaient positives (Fig. 7 C)., À la dilution suivante, contenant 1 ng d’ADN cible par réaction, de 24 aliquotes seulement 3 ont donné des réactions positives (Fig. 7 D). Dans les dilutions contenant 18 NG ou plus D’ADN cible par réaction, toutes les aliquotes ont donné une réaction positive, tandis que dans les dilutions contenant <1 ng, toutes les aliquotes ont donné des réactions négatives (données non présentées)., La concentration relative d’ADN nécessaire pour produire une réaction positive détectant le réarrangement, comparée à celle nécessaire pour produire une réaction positive détectant la structure de type sauvage, est proportionnelle à la concentration relative de structures de type sauvage réarrangées dans l’ADN cible.

Concentration Relative de Structures réarrangées dans différents échantillons d’ADN provenant de cellules somatiques.

La stratégie de dilution illustrée ci-dessus a été utilisée pour détecter la concentration relative de points d’arrêt de réarrangement dans des échantillons D’ADN d’individus non apparentés., L’ADN a été extrait de cellules sanguines de nouveau-nés (sang de cordon ombilical) ou d’adultes (Voir matériaux et méthodes). Pour chaque échantillon D’ADN, plusieurs aliquotes de différentes dilutions ont été utilisées comme cibles pour les PCR pour détecter à la fois le type sauvage (noyau a) et la structure réarrangée correspondante dérivée des événements d’inversion des régions IR-1, IR-2 et IR-3. Plusieurs aliquotes de dilutions appropriées ont été utilisées, et la concentration relative d’ADN cible pour produire une réaction positive détectant le type sauvage ou la structure réarrangée correspondante a été calculée., Le rapport de la concentration des structures de type sauvage sur celle des structures réarrangées des différents ADN cibles est présenté dans une échelle logarithmique dans la Fig. 8.

Les huit personnes testées ont présenté inversion des réarrangements dans les trois régions analysées. Cependant, la concentration relative des réarrangements variait d’un échantillon à l’autre et d’une région à l’autre. Aux extrêmes, un échantillon d’ADN nouveau-né présentait ≈105 structures de type sauvage par une structure inversée dans la région IR-1 (individu 6), alors que certains échantillons adultes présentaient environ deux structures de type sauvage par une structure inversée dans la région IR-3 (individus 1 et 3)., Dans tous les échantillons, la région IR – 3 présentait une concentration relative de structures réarrangées plus élevée que les régions IR-1 et IR-2. La conclusion la plus frappante a été que, pour les trois régions analysées, L’ADN isolé au moment de la naissance contenait une concentration significativement plus faible de structures réarrangées que celle isolée chez les individus adultes. La différence des valeurs moyennes entre les deux groupes était significative pour les trois régions, IR-1 (P < 0.02), IR-2 (P < 0,001), et IR-3 (P < 0.,001), en utilisant une analyse de variance. Le rapport des valeurs moyennes entre les deux groupes était de 17, 70 et 166 fois pour les régions IR-1, IR-2 et IR-3, respectivement.