rezultate
rațiune pentru analiza dinamicii genomului uman.pentru a studia dinamica genomului uman, am vizat detectarea punctelor de întrerupere a rearanjării cromozomiale. Aceasta necesită disponibilitatea unei secvențe de referință genomică de foarte bună calitate. Secvența actuală a genomului uman îndeplinește astfel de standarde de calitate, conținând puține lacune cu o rată de eroare estimată foarte scăzută (26)., Pentru acest studiu, a fost folosit Centrul Național pentru Informații Biotehnologice (NCBI) Build 36 versiune a secvenței genomului uman de referință.
pentru a identifica site-urile potențiale pentru NAHR, secvența genomului uman de referință a fost analizată mai întâi pentru a găsi regiuni cromozomiale cu identitate de secvență înaltă. Dacă se va produce un eveniment de recombinare mediat de NAHR, se așteaptă să se formeze noi structuri genomice., Mai mult, dacă aceste evenimente au avut loc în celulele somatice, atunci aceste noi structuri genomice ar fi prezise a fi prezente într-o fracțiune foarte mică din totalul celulelor analizate, marea majoritate a celulelor conținând structura genomică nerearanjată corespunzătoare (denumită aici structuri de tip sălbatic). Dovezi pentru acest lucru pot fi găsite în alte organisme, cum ar fi bacteriile (24, 25). Prin urmare, pentru a identifica astfel de rearanjări cromozomiale, este necesară o procedură experimentală foarte sensibilă și specifică., În opinia noastră, în prezent, tehnica de alegere pentru acest tip de studiu ar fi un test bazat pe PCR folosind primeri de oligonucleotide definiți corespunzător.studiul de față este axat pe inversiuni ADN derivate din evenimente NAHR între perechi de secvențe repetate situate în orientare inversă care pot genera inversiuni ADN. Schema prezentată în Fig. 1 a exemplifică o pereche de structuri de tip sălbatic, notate ca a și b, și rearanjarea inversă corespunzătoare care poate fi produsă de NAHR (Fig. 1 B), împreună cu primerii PCR necesari pentru detectarea diferitelor structuri., Primerii trebuie să se potrivească regiunilor proximale, deși externe, cu repetițiile. Dacă pentru testul PCR se utilizează primeri înainte și invers care flancează una dintre repetări, atunci se detectează structura de tip sălbatic corespunzătoare (Fig. 1 A). Un punct de întrerupere a inversiunii poate fi detectat utilizând fie ambii primeri înainte (Fa și Fb), fie ambii primeri inversori (Ra și Rb) (Fig. 1 B). În funcție de poziția primerilor corespunzători în secvența de nucleotide, se poate calcula dimensiunea exactă a fragmentului PCR așteptat.
detectarea structurilor de tip sălbatic și rearanjate prin PCR. (A) secvențe repetate în orientare inversă. (B) structuri formate printr-o rearanjare inversiune. Săgețile mari albe sau negre reprezintă miezurile identice de tip sălbatic a și, respectiv, b (vezi rezultatele); săgețile mari mixte (albe și negre) reprezintă miezurile repetate după rearanjare. Săgețile negre subțiri reprezintă primeri PCR: Fa, primer înainte al regiunii a; Ra, primer invers al regiunii a; Fb, primer înainte al regiunii b, Rb, primer invers al regiunii b (vezi rezultatele)., Săgețile punctate reprezintă ADN-ul dintre secvențele repetate corespunzătoare; liniile solide reprezintă ADN-ul în afara segmentului care conține secvențele repetate corespunzătoare.
selectarea secvențelor repetate pentru a analiza dinamica genomului.
regiunile genomice de studiat au fost selectate printr-o procedură bioinformatică în mai multe etape schematizată în Fig. 2., Primul pas a constat în identificarea tuturor perechi de intrachromosomal inversat secvențe format din două nuclee, a și b, de cel puțin 400 de nucleotide în lungime de partajare 100% secvență de identitate (vezi Materiale și Metode). Aceste perechi de secvențe sunt denumite aici secvențe inversate recombinogene potențiale (PRIS) (Fig. 2 A). Un total de 24,547 PRIS au fost găsite în NCBI Build 36 a genomului uman de referință. La PRIS sunt distribuite între toate cele 24 de cromozomi diferiți, și nuclee care cuprinde aceste PRIS variat în lungime de la 400 la 74,868 nucleotide., Numărul total de nucleotide prezente în PRIS neredundante a fost de 31.115.694 bp, reprezentând ≈1% din genomul uman. Ulterior, am restricționat căutarea noastră la PRIS formate din nuclee mai mici de 4 kb în lungime și, prin urmare, care ar putea fi amplificate eficient prin metodologii PCR standard (N = 24,001; Fig. 2 B), urmat de un criteriu de căutare arbitrar suplimentar prin care distanța care separă nucleele corespunzătoare ale unui PRIS a fost între 4 kb și 100 kb (n = 1,442; Fig. 2 C). Distribuția genomică a acestui set de PRIS este prezentată în Fig. 3.
calea fluxului de lucru Bioinformatic pentru a selecta regiuni adecvate pentru a studia dinamica genomului uman prin PCR. Diferite etape ale căii fluxului de lucru așa cum este descris în text. Zonele gri închis reprezintă nuclee identice a și b din fiecare regiune. Zonele gri deschis reprezintă regiuni omoloage adiacente miezurilor identice. Zonele negre reprezintă repetiții comune ale genomului uman. Zonele albe reprezintă segmente ADN care pot fi utilizate pentru a proiecta primerii PCR corespunzători. Săgețile punctate reprezintă ADN-ul prezent între nucleele identice ale regiunii corespunzătoare., Liniile negre reprezintă poziția primerilor: Fa, primer (i) înainte din regiunea a; Ra, primer (i) invers al regiunii a; Fb, primer (i) înainte al regiunii b; Rb, primer (i) invers al regiunii b. restricțiile impuse în diferite etape sunt indicate în prima etapă în care au fost introduse (Vezi rezultatele). Numerele de PRI rămase după diferitele restricții impuse sunt indicate în paranteză; din Pasul F, din cele 35 de PRI rămase doar 10 au fost analizate (Vezi rezultatele).
localizarea PRIS de dimensiuni moderate în cromozomii umani., Începând din partea stângă a figurii, cromozomii umani 1-22, X și Y sunt aliniați de centromere (indicați prin puncte în partea stângă și dreaptă a figurii). Brațul p este prezentat în partea de sus și brațul q în partea de jos a fiecărui cromozom. Liniile indică poziția 1,442 PRIS format din două nuclee de intrachromosomal inversat secvențe de ADN-ul de partajare de 100% identitate cu dimensiuni variind de la 400 la 4.000 de nucleotide și este situat la o distanță între 4 kb și 100 kb (a se vedea Rezultatele). Setul de PRIS funcțional (Vezi rezultatele) este indicat prin linii roșii., Triunghiurile roșii corespund celor trei PRIS analizate în acest studiu și menționate în text ca regiuni IR-1 (în cromozomul 19), IR-2 (în cromozomul 15) și IR-3 (în cromozomul 3).pentru a proiecta primeri adecvați care să flanceze cele două nuclee ale PRIS-ului corespunzător, este imperativă prezența zonelor de secvență ADN „unică” în amonte și în aval de fiecare miez. Ne referim aici la secvența ADN „unică” ca una în comparație cu marginile corespunzătoare ale fiecărui nucleu al PRIS și nu la întregul genom., Este important de subliniat faptul că majoritatea nucleelor sunt de fapt scufundate în regiuni omoloage mai mari care prezintă o identitate ridicată, denumite de obicei duplicări segmentale (22). Am determinat gradul de identitate a secvenței în regiunile adiacente nucleelor corespunzătoare ale fiecăruia dintre PRIS prin alinierea globală (vezi materiale și metode) a secvenței ADN a fiecărui nucleu extins cu 2 kb în amonte și 2 kb în aval. Analiza celor 1.442 de aliniamente a determinat că doar 76 de PRI conțin zone de secvență ADN „unică” (Fig. 2 D).,mai mult, prezența secvențelor ADN reiterate în alte locații ale genomului ar putea afecta performanța primerilor PCR corespunzători. Cele mai proeminente elemente reiterate ale genomului uman sunt așa-numitele repetări comune. Aceste repetiții includ repetiții tandem simple și cu complexitate redusă, cum ar fi microsateliți și minisateliți, elemente nucleare intercalate scurte și lungi, transpozoni ADN și ARN-uri ribozomale și de transfer, printre altele. A fost determinată prezența repetițiilor comune în granițele fiecărui nucleu al celor 75 de PRIS (vezi materiale și metode)., Au fost selectate doar cele care prezintă cel puțin 200 bp de secvență ADN „unică” lipsită de repetări comune în ambele margini ale fiecărui PRIS. Această selecție a avut ca rezultat un set de 35 PRIS viabile (Fig. 2 E).,
În rezumat, în funcție de diferitele restricții impuse în prezentul studiu, fiecare funcțional PRIS este format din două nuclee, a și b, de intrachromosomal inversat secvențe de ADN-ul de partajare de 100% de identitate, cu dimensiuni variind de la 400 la 4.000 de nucleotide, situat la o distanță între 4 kb și 100 kb, iar prezentarea a cel putin 200 bp de secvență unică în zonele situat la 2 kb amonte și 2 kb aval de fiecare nucleu (a se vedea schema din Fig. 2 E). Acest set funcțional de PRIS este distribuit între majoritatea cromozomilor și este evidențiat în Fig., 3; locațiile nucleelor fiecărui PRIS, dimensiunile acestora și distanța dintre ele sunt enumerate în tabelul 1 cu informații justificative (SI).
proiectarea primerilor valide pentru a analiza dinamica genomului.
Din acest set de PRIS viabile, am selectat în mod arbitrar 10 pentru a proiecta primeri PCR. Din experiența noastră folosind metoda PCR pentru a detecta rearanjamentele în genomul bacterian, am realizat că este important să proiectăm și să testăm mai mulți primeri PCR care să flanceze fiecare dintre secvențele repetate selectate (24)., În consecință, patru primeri înainte au fost proiectați în regiunea amonte și patru primeri inversi au fost proiectați în regiunea aval a celor două nuclee, a și b, ale fiecăruia dintre PRIS-urile selectate. Proiectarea fiecărui primer a inclus analiza locurilor sale potențiale de amorsare în întregul genom și capacitatea sa de a genera produse PCR în silico atunci când sunt combinate cu alți primeri potențiali (vezi materiale și metode). Toți primerii selectați ca în silico-valid au fost foarte specifici pentru a detecta Regiunea genomică corespunzătoare., În plus, atunci când au fost combinate pentru a detecta rearanjarea inversă corespunzătoare, nu au fost raportate produse din silico.din cele 10 pri selectate, am putut proiecta în grunduri PCR silico-valide pentru 8 dintre ele (Fig. 2 F). Cei 32 de primeri PCR corespunzători ai fiecăruia dintre cei opt pri selectați au fost sintetizați și testați experimental. Cele 16 combinații de oligonucleotide pentru a detecta fiecare dintre nucleele setului de opt PRIS în configurația de tip sălbatic au fost utilizate pentru a primi PCR-uri folosind o probă de ADN derivată din celulele sanguine ca țintă., Au fost acceptați numai acei primeri care produc un singur produs PCR de dimensiunea preconizată. Dacă gelurile de electroforeză pentru detectarea produselor PCR au fost supraîncărcate, atunci, în unele cazuri, s-au observat benzi secundare slabe; această situație a fost considerată acceptabilă. Din produsele PCR acceptabile am dedus primerii PCR valabili.
pentru analiza punctelor de întrerupere a inversiunii, am folosit setul de opt PRIS cu primeri PCR valabili. Fiecare PRIS din acest set avea cel puțin doi primeri valabili înainte și doi primeri valabili invers pentru fiecare miez (Fig. 2 G)., Toate combinațiile de primeri valide au fost folosite pentru a căuta punctele de întrerupere inversiune în fiecare PRIS. Este important de subliniat faptul că, spre deosebire de reacțiile care detectează structurile de tip sălbatic, PCR-urile primare pentru detectarea rearanjării inversiunii nu au produs, de obicei, benzi vizibile după colorarea gelurilor cu bromură de etidiu (vezi mai jos). Acest rezultat a fost așteptat, deoarece numărul de celule care conțin rearanjarea vizată este de așteptat să fie foarte diluat în eșantionul testat., Prin urmare, secundar Pcr, de obicei, imbricate sau heminested, au fost efectuate folosind o porțiune din produsul de reacție primară și toate combinațiile posibile de primeri adecvate. Dovezi potențiale pentru o rearanjare (Fig. 2 H) a fost luată în considerare atunci când combinația adecvată de primeri a produs un produs PCR cu dimensiunea așteptată a fragmentului rearanjat și fără benzi secundare. Din cele opt PRIS analizate, în șase cazuri am avut dovezi potențiale clare de rearanjări inversive., Pentru a stabili că produsul PCR a fost un fragment recombinant care conține regiunile corespunzătoare adiacente miezului a la un capăt și miezului b la celălalt capăt (vezi mai sus și Fig. 1), a fost obținută secvența nucleotidică a marginilor produselor PCR. Fragmentele selectate au prezentat o secvență ADN care se potrivea cu cea a regiunii inversate așteptate. În unele cazuri, am detectat abateri minore de la secvența de referință care ar trebui să corespundă SNP-urilor sau mutațiilor (datele nu sunt prezentate)., Cele șase PRIS care au arătat dovezi ale rearanjărilor inversiunii corespund numerelor 5, 6, 7, 13, 22, și 27 în tabelul SI 1. Cinci dintre ele sunt localizate în genele umane cunoscute; în două cazuri, nucleele corespunzătoare se suprapun cu exonii (PRIS 22 și 27), în timp ce în celelalte trei, ambele nuclee sunt conținute în același intron (PRIS 5, 6 și 13).
asamblarea kiturilor de rearanjare.pentru experimente suplimentare, am selectat PRIS 27, situat pe cromozomul 19; PRIS 22, Situat pe cromozomul 15; și PRIS 6, situat pe cromozomul 3., Aceste pri vor fi notate aici ca regiuni inversate 1 (IR-1), 2 (IR-2) și, respectiv, 3 (IR-3) și sunt indicate în Fig. 3. Pentru fiecare regiune, am pregătit un set de primeri care constituie un „kit de rearanjare” (RKit) (si tabelul 2). Fiecare RKit este compus din toți primerii PCR necesari pentru a efectua PCR-urile primare și secundare pentru detectarea următoarelor structuri specifice ale fiecărei regiuni selectate: miezul a, miezul b și structura recombinantă derivată din inversiune., Un alt reactiv al fiecărui RKit conține o pereche de primeri pentru a obține un fragment PCR din secvența identică corespunzătoare miezurilor; atunci când este etichetat cu radioactivitate, acest fragment poate fi utilizat ca sondă de hibridizare pentru a detecta oricare dintre produsele PCR corespunzătoare regiunii specifice.după cum sa menționat mai sus, pentru a valida fragmentele corespunzătoare rearanjamentelor De Inversiune, a fost determinată secvența nucleotidică a marginilor produselor PCR corespunzătoare., Produsele PCR obținute cu primerii specifici incluși în Rkit-urile corespunzătoare din regiunile IR-1, IR-2 și IR-3 au fost validate în continuare. Fiecare produs PCR a fost clonat, iar marginile inserțiilor din trei plasmide recombinante, care în toate cazurile au arătat dimensiunea fragmentului ADN așteptat, au fost secvențiate (vezi materiale și metode)., Pentru toate RKits utilizate în acest studiu, secvența de nucleotide din ambele produsul de PCR și de a introduce de clone derivate din acesta constată prezența de așteptat frontierele de puncte de întrerupere derivate din aceeași inversiune rearanjare. Reactivii RKits sunt prezentați în tabelul SI 2. Un exemplu de produse PCR reprezentând diferitele structuri ale fiecăreia dintre regiunile selectate ale genomului este prezentat în Fig. 4.
Fig. 4.
detectarea structurilor de tip sălbatic și rearanjate prin PCR., Total ADN-ul uman izolat de celule sanguine de la un individ adult (vezi Materiale și Metode) a fost folosit ca țintă pentru PCR amorsate cu oligonucleotide indicat în SI Tabelul 2 pentru RKits corespunzătoare regiunilor IR-1 (Stânga), IR-2 (Centru), și IR-3 (Dreapta). (Superioară) sunt prezentate produsele PCR colorate cu bromură de etidiu. (Inferior) sunt prezentate autoradiografiile bloturilor sudice ale gelurilor prezentate în bloturile superioare hibridizate cu sonda corespunzătoare pentru fiecare regiune., A, PCR-uri corespunzătoare miezului a; B, PCR-uri corespunzătoare miezului b; C, PCR-uri corespunzătoare structurii formate prin rearanjarea inversiunii. Migrarea produșilor PCR corespunde lor de așteptat dimensiuni în bp, care sunt după cum urmează: 2,603; 2,845; 2,876; 2,070; 2,885; 2,694; 3,344; 2,894; și 2,806 de la stânga la dreapta.
caracteristicile Regiunilor selectate pentru a detecta rearanjamentele genomice.
detectarea structurilor de tip sălbatic și rearanjate prin PCR., Total ADN-ul uman izolat de celule sanguine de la un individ adult (vezi Materiale și Metode) a fost folosit ca țintă pentru PCR amorsate cu oligonucleotide indicat în SI Tabelul 2 pentru RKits corespunzătoare regiunilor IR-1 (Stânga), IR-2 (Centru), și IR-3 (Dreapta). (Superioară) sunt prezentate produsele PCR colorate cu bromură de etidiu. (Inferior) sunt prezentate autoradiografiile bloturilor sudice ale gelurilor prezentate în bloturile superioare hibridizate cu sonda corespunzătoare pentru fiecare regiune., A, PCR-uri corespunzătoare miezului a; B, PCR-uri corespunzătoare miezului b; C, PCR-uri corespunzătoare structurii formate prin rearanjarea inversiunii. Migrarea produșilor PCR corespunde lor de așteptat dimensiuni în bp, care sunt după cum urmează: 2,603; 2,845; 2,876; 2,070; 2,885; 2,694; 3,344; 2,894; și 2,806 de la stânga la dreapta.
regiunile selectate pentru a analiza apariția rearanjamentelor genomice sunt schematizate în Fig. 5., Sunt prezentate atât structura de tip sălbatic, cât și cea derivată dintr-o inversiune datorată NAHR a nucleelor identice corespunzătoare.
caracteristicile regiunilor analizate pentru a detecta rearanjamentele de inversiune în genomul uman. (A) structura de tip sălbatic a IR-1. (B) structura inversată a IR-1. (C) Structura de tip sălbatic a IR-2. (D) structura inversată a IR-2. (E) structura de tip sălbatic a IR-3. (F) structura inversată a IR-3. Liniile solide orizontale corespund genelor care adăpostesc miezurile care participă la rearanjare; zonele solide verticale corespund exonilor unor astfel de gene., În IR-1 și IR-2 în cazul în care două gene omoloage, SAFB2/SAFB și DUOX2/DUOX1, respectiv, să participe la reorganizare, o genă este afișată în roșu și unul este afișat în albastru. În IR-3, Gena în care este localizată rearanjarea este prezentată în gri. Săgețile verzi indică locul de inițiere și direcția de transcriere a fiecărei gene. Liniile punctate reprezintă ADN-ul între sau în afara genelor implicate în rearanjări. Miezurile identice ale fiecărei regiuni sunt reprezentate ca dreptunghiuri., Scala de dimensiuni este diferită pentru fiecare regiune și este extinsă în nucleele identice; dimensiunea fiecărui miez este indicată deasupra unei săgeți solide care arată orientarea relativă a fiecărui miez. Restul scalei este similar pentru diferitele structuri prezente, dar este diferit pentru fiecare regiune. Scalele pot fi deduse din dimensiunea segment de ADN între nuclee identice în fiecare regiune; 36,924; 24,128; și 7,935 bp pentru IR-1, IR-2, și IR-3, respectiv. În IR-2, este indicată prezența genei NIP în regiunea dintre genele DUOX2 și DUOX1.,nucleele identice a și b ale regiunii IR-1 sunt fragmente de ADN de 941 bp separate de 36,925 bp. Nucleul a conține exonul 7 și o parte din intronii 6-7 și 7-8 ai genei SAFB2; nucleul b conține exonul 7 și o parte din intronii 6-7 și 7-8 ai genei SAFB (Fig. 5 A). Genele SAFB2 și SAFB sunt gene paraloge transcrise în direcția opusă. Funcția acestor gene a fost propusă a fi implicată în organizarea cromatinei, reglarea transcripțională, îmbinarea ARN și răspunsul la stres (27). Așa cum se arată în Fig., 5 B, o rearanjare de inversiune derivată din Nahr mediată de cele două nuclee identice ar modifica structura celor două gene.în regiunea IR-2, nucleele identice sunt întinderi de ADN de 482 bp separate de 24,129 bp. Nucleul a include exonul 7 și o parte din exonul 6, precum și intronul 6-7 și o parte din intronul 7-8 al genei DUOX2 (Fig. 5 C). Nucleul b include exonul 8 și o parte din exonul 7, precum și intronul 7-8 și o parte din intronul 8-9 al genei DUOX1 (Fig. 5 C). Aceste gene au fost adnotate ca oxidaze NADPH și s-a constatat că sunt puternic exprimate în celulele tiroidiene (28)., În regiunea dintre genele DUOX2 și DUOX1, se află o altă genă, NIP. Ca și în cazul SAFB2 și SAFB, gene DUOX2 și DUOX1 sunt paralogous gene transcrise în direcția opusă. În consecință, inversiunea mediată de NAHR a celor două nuclee identice (Fig. 5 D) ar modifica structura genelor.în cazul regiunii IR-3, nucleele identice sunt segmente de ADN de 885 bp separate de 7,935 bp. Ambele fac parte dintr-o structură comună de repetare, o repetare terminală lungă și sunt situate în același intron, intron 3, al genei RNF13 (Fig. 5 E)., Această genă a fost adnotată ca o proteină deget inel de zinc; funcția sa specifică nu a fost determinată. Inversiunea rezultată din NAHR între cele două nuclee (Fig. 5 F) ar avea ca rezultat o modificare minoră a structurii genei, situată în interiorul intronului 3 și, probabil, nu ar avea relevanță fiziologică.
cinetica timpului de detectare a rearanjamentelor prin PCR.
folosind reactivii dintr-un RKit, PCR-urile au fost efectuate pentru a detecta structuri de tip sălbatic sau rearanjate. Au fost efectuate atât reacții primare, cât și secundare, iar alicotele au fost analizate la diferite cicluri., Alicotele au fost supuse electroforezei în gel de agaroză și au fost dezvăluite atât prin colorarea bromurii de etidiu, cât și prin bloturile sudice hibridizate împotriva unei sonde radioactive. Un exemplu care utilizează Regiunea IR-1 și un ADN țintă din celulele sanguine este prezentat în Fig. 6.
cinetica timpului PCR pentru detectarea structurilor de tip sălbatic și inversat. O probă de ADN de 100 ng din celulele sanguine ale unui individ adult a fost utilizată ca țintă pentru PCR., Reacțiile au fost amorsate cu oligonucleotide pentru a detecta structura de tip sălbatic a nucleului a (A și B) și a structurii inversate (C și D) a regiunii IR-1 (așa cum este indicat în tabelul SI 2). (Stânga) reacție primară PCR. (Dreapta) reacție secundară PCR. Alicotele au fost luate la fiecare 3 cicluri, de la ciclul 3 la ciclul 30. Produsele PCR au fost dezvăluite fie cu bromură de etidiu (A și C), fie prin bloturi sudice hibridizate cu sonda corespunzătoare (B și D).,
în PCR care dezvăluie structura de tip sălbatic, colorarea cu bromură de etidiu a arătat fragmentul așteptat de la reacția primară (Fig. 6 A), în timp ce structura corespunzătoare punctului de întrerupere a rearanjării inversiunii a fost dezvăluită numai până la reacția secundară, în acest caz imbricată (Fig. 6 C). Folosind Southern blots, am putea demonstra că fragmentul care dezvăluie punctul de rupere al structurii rearanjate este de fapt produs în reacția primară (Fig. 6 D).,cinetica timpului PCR poate fi utilizată ca metodă semiquantitativă pentru a estima proporția relativă a structurilor rearanjate în comparație cu structurile de tip sălbatic. Cu toate acestea, această tehnică este doar o aproximare, deoarece dublarea produsului PCR în fiecare ciclu este de obicei obținută în cazul produselor mici și în anumite condiții specifice, cum ar fi cele utilizate pentru PCR cantitativ. Pentru a cuantifica proporția relativă a rearanjărilor într-o probă de ADN, am decis să folosim o metodă mai fiabilă bazată pe diluarea ADN-ului țintă (vezi mai jos).,
cinetica diluării detectării rearanjamentelor prin PCR.
când ADN-ul țintă pentru un PCR este diluat și reacția este amorsată pentru a detecta o structură de tip sălbatic, se atinge o diluție în care nu se găsește niciun produs. Această diluție trebuie să fie aproape de o concentrație țintă de ADN de aproximativ un genom haploid per reacție. În schimb, dacă reacția este amorsată pentru a detecta o rearanjare, atunci diluția la care nu se găsește niciun produs trebuie să fie proporțională cu concentrația relativă a rearanjării respective în proba de ADN. Un experiment tipic este prezentat în Fig., 7 prin utilizarea unei probe de ADN din celulele sanguine ca țintă. Wild-tip de structură corespunde o bază de regiunea IR-1-a dat pozitiv Pcr până la o diluție conține ≈10 pg de ADN per reacție; la o concentrație de 3 pg per reacție, teoretic, ceva mai puțin decât un genom haploid pe reacție, nici PCR produs a fost observat (Fig. 7 A). În schimb, când PCR a fost amorsat pentru a detecta punctul de întrerupere a inversiunii, reacția care conține ≈3 ng a fost încă pozitivă, în timp ce reacțiile care conțin 1 ng sau mai puțin au fost toate negative (Fig. 7 B).
cinetica diluării pentru detectarea structurilor de tip sălbatic și inversat. O probă de ADN din celulele sanguine ale unui individ adult a fost utilizată ca țintă pentru PCR. PCR a fost amorsat cu oligonucleotide pentru a detecta structura de tip sălbatic a miezului a (A) și structura inversată (B–D) A IR-1 (așa cum este indicat în tabelul SI 2). Produsele PCR au fost dezvăluite de bromura de etidiu după electroforeza în gel. (A și B) au fost utilizate cantități diferite de ADN: 1, 100 ng; 2, 33 ng; 3, 10 ng; 4, 3 ng; 5, 1 ng; 6, 333 pg; 7, 100 pg; 8, 33 pg; 9, 10 pg, 10, 3 pg., (C și D) douăzeci și patru de alicote diferite care conțin 3 ng (C) sau 1 ng (D) de ADN au fost utilizate pentru a detecta structura inversată.este important de reținut că, așa cum era de așteptat, la diluțiile care prezintă ultima reacție pozitivă sau prima reacție negativă, unele alicote prezintă reacții pozitive și unele negative. Această constatare este ilustrată în Fig. 7 C și D pentru PCR-uri care detectează rearanjarea inversiunii. Din 24 de alicote ale diluției care conțin 3 ng de ADN țintă pe reacție, 17 au fost pozitive (Fig. 7 C)., La următoarea diluție, conținând 1 ng de ADN țintă pe reacție, de 24 de alicote, numai 3 au dat reacții pozitive (Fig. 7 D). În diluții conțin 18 ng sau mai ADN-ul țintă pe reacție, toate alicote a dat o reacție pozitivă, întrucât în diluții conțin <1 ng, toate alicote a dat reacții negative (datele nu sunt prezentate)., Concentrația relativă de ADN-ul necesar pentru a produce o reacție pozitivă detectarea reorganizare, comparativ cu cel necesar pentru a produce o reacție pozitivă detectarea de tip sălbatic structura, este proporțională cu concentrația relativă a rearanjat vs wild-tip de structuri în ADN-ul țintă.
concentrația relativă a structurilor rearanjate în diferite probe de ADN derivate din celule somatice.
strategia de diluare exemplificată mai sus a fost utilizată pentru a detecta concentrația relativă a punctelor de întrerupere a rearanjării în probele de ADN de la indivizi independenți., ADN-ul a fost extras din celulele sanguine ale nou-născutului (sângele cordonului ombilical) sau ale persoanelor adulte (vezi materiale și metode). Pentru fiecare probă de ADN, mai multe alicote din diferite diluții au fost utilizate ca ținte pentru PCR-uri pentru a detecta atât tipul sălbatic (miezul a), cât și structura rearanjată corespunzătoare derivată din evenimentele de inversiune ale regiunilor IR-1, IR-2 și IR-3. S-au folosit mai multe alicote de diluții adecvate și s-a calculat concentrația relativă a ADN-ului țintă pentru a produce o reacție pozitivă detectând fie tipul sălbatic, fie structura rearanjată corespunzătoare., Raportul dintre concentrația structurilor de tip sălbatic față de cea a structurilor rearanjate ale diferitelor ADN-uri țintă este prezentat într-o scară logaritmică în Fig. 8.
concentrația relativă a structurilor de tip sălbatic și inversat în probele de ADN izolate de la diferite persoane nonrelaționate. ADN-ul izolat din celulele sanguine ale diferitelor persoane a fost utilizat ca țintă pentru PCR. Reacția a fost amorsată cu oligonucleotidele indicate în tabelul SI 2 pentru a detecta miezurile a sau structurile inversate ale IR-1, IR-2 și IR-3., Cantitatea de structuri de tip sălbatic și inversat a fost determinată prin analizarea mai multor alicote din probe care conțin cantități diferite de ADN (Vezi rezultatele). Cantitatea relativă de structuri de tip sălbatic față de structurile inversate este indicată într-o scară logaritmică. 1-4, probe de ADN de la patru indivizi adulți diferiți; 5-8, probe de ADN din sângele cordonului ombilical de la patru nou-născuți diferiți (vezi materiale și metode); a, valoarea medie pentru ADN de la indivizi adulți; B, valoarea medie pentru ADN de la indivizi nou-născuți.,cei opt indivizi testați au prezentat rearanjamente de inversiune în cele trei regiuni analizate. Cu toate acestea, concentrația relativă a rearanjamentelor a variat atât între eșantioane, cât și între regiuni. La extreme, un eșantion de ADN nou-născut a prezentat ≈105 structuri de tip sălbatic pe o structură inversată în regiunea IR-1 (individul 6), în timp ce unele probe adulte au prezentat aproximativ două structuri de tip sălbatic pe o structură inversată în regiunea IR-3 (indivizii 1 și 3)., În toate probele, Regiunea IR-3 a prezentat o concentrație relativă mai mare de structuri rearanjate decât regiunile IR-1 și IR-2. Cea mai izbitoare constatare a fost că, pentru cele trei regiuni analizate, ADN-ul izolat la momentul nașterii conținea o concentrație semnificativ mai mică de structuri rearanjate decât cea izolată de indivizii adulți. Diferența de valori între cele două grupuri a fost semnificativă pentru cele trei regiuni, IR-1 (P < 0.02), IR-2 (P < 0.001) și IR-3 (P < 0.,001), utilizând o analiză unidirecțională a varianței. Raportul valorilor medii între ambele grupuri a fost de 17, 70 și 166 ori pentru regiunile IR-1, IR-2 și, respectiv, IR-3.
