T4 ADN Ligase: la seule Ligase dont vous aurez besoin?

Les ADN ligases, y compris L’outil de biologie moléculaire T4 ADN ligase, sont des enzymes qui facilitent la jonction des brins D’ADN en catalysant la formation de la liaison phosphodiester entre les groupes 5’-PO4 et 3’-OH de l’épine dorsale de l’ADN. Chez les organismes, L’ADN ligase joue un rôle important dans la réparation des ruptures de L’ADN introduites lors de la réplication et des dommages, assurant ainsi l’intégrité de l’information génétique.,

la découverte des ADN Ligases

compte tenu de leur rôle vital dans la réparation et la réplication de l’ADN, l’activité de L’ADN ligase dans les cellules a été proposée Pour exister avant même leur découverte. Deux observations ont stimulé la recherche d’ADN ligases.

1. l’apparition de la recombinaison génétique par rupture et ré-assemblage de molécules D’ADN.
2. la formation de cercles fermés par L’ADN linéaire du bactériophage I après infection.

en 1967, des ADN ligases ont été découvertes indépendamment par les laboratoires Gellert, Lehman, Richardson et Hurwitz., Depuis leur découverte, les ADN ligases sont devenus des outils importants en biologie moléculaire. Des ligases D’ADN sont employées dans le clonage moléculaire pour joindre des fragments D’ADN ensemble pour créer L’ADN recombinant, comme quand un morceau d’ADN étranger est inséré dans un plasmide.

la plupart des réactions de ligature impliquent des fragments D’ADN qui ont été générés à partir de digestes de restriction, avec des extrémités cohésives ou émoussées., La ligature est généralement effectuée comme une réaction distincte après la digestion de restriction bien que certains protocoles décrivent une méthode de clonage par PCR à un tube où la digestion de restriction et la ligature sont autorisées à se produire simultanément dans la même réaction.

T4 DNA Ligase: la seule Ligase dont vous aurez besoin?

L’ADN ligase T4 est la ligase la plus utilisée en biologie moléculaire. Comme ses parents, les ligases T3 et T7, il porte le nom du bactériophage à partir duquel il a été identifié pour la première fois. C’est une ADN ligase dépendante de L’ATP car elle hydrolyse L’ATP lors de la liaison covalente des groupes 5’-PO4 et 3’-OH.,

cette ligase polyvalente est recommandée pour la plupart des applications de clonage moléculaire de routine car elle peut ligaturer à la fois des fragments d’ADN double brin émoussés et cohésifs (généralement entre un vecteur plasmidique et un insert) ainsi que le clonage T / A.

en raison de la polyvalence de L’ADN ligase T4 dans la ligature des extrémités cohésives et émoussées, il a été optimisé pour une gamme de conditions pour une ligature rapide et efficace. Certaines variantes de L’ADN ligase T4 ont été conçues pour résister à une teneur élevée en sel et à des températures élevées jusqu’à 50°C., De telles ligases D’ADN sont utiles pour des réactions de ligature avec des concentrations élevées de sel ou des températures élevées. Effectuer une ligature à des températures plus élevées réduit le temps d’incubation et augmente la spécificité de la ligature. T4 ADN ligase a également été utilisé pour la ligature rapide, dans lequel la réaction se produit en 5 minutes à température ambiante au lieu de la nuit à 16°C, en utilisant un tampon spécialement optimisé qui augmente l’efficacité de la ligature. Choisissez une ADN ligase rapide si vous êtes pressé!

alors, la ligase T4 DNA est – elle la seule ligase dont vous aurez besoin?, Bien qu’il effectue de nombreuses applications standard des ligases D’ADN en laboratoire, il présente certains inconvénients.

il N’est pas particulièrement tolérant au sel

l’activité des ligases D’ADN T4 commence à diminuer rapidement lorsque les concentrations de sel dépassent 200 mM, donc si les conditions de votre ligature impliquent des niveaux élevés de sel (par exemple lorsque le report de sel est un problème des étapes précédentes), vous

Heureusement, d’autres options sont disponibles., L’ADN ligase T3, qui peut également ligaturer des fragments d’ADN émoussés et collants, peut tolérer des concentrations de sel allant jusqu’à 250-300 mM. cependant, ce n’est pas votre seule option. Des variantes de la ligase T4 pouvant résister à des concentrations de sel allant jusqu’à 500 mM ont été créées, telles que la ligase D’ADN Salt-T4.

il ligature les extrémités émoussées ainsi que les extrémités cohésives

bien que cela ne semble pas être un problème, il peut arriver que vous ayez à la fois de l’ADN cohésif et de l’ADN émoussé dans une réaction et que vous souhaitiez uniquement ligaturer les extrémités cohésives., Dans cette situation, L’ADN ligase T7 est votre ami car il ne ligature pas les extrémités émoussées.

L’ADN ligase D’E. coli est un autre choix dans ce scénario. Cette ligase ne ligate pas les extrémités émoussées et a une affinité plus élevée pour les extrémités cohésives que la ligase T4. L’ADN ligase d’E. coli est une ligase dépendante de NAD+, donc le tampon que vous utilisez sera différent de la ligase T4.

il peut ligaturer les discordances dans les entailles

L’ADN ligase T4 est une ligase très active, et alors qu’en général les ADN ligases préfèrent ligaturer complètement L’ADN jumelé à la base Watson-Crick, la ligase T4 peut ligaturer les discordances dans les entailles D’ADN., Si la ligature haute fidélité de L’ADN entaillé est votre objectif, alors la NAD+ dépendante Taq ADN ligase est l’outil pour le travail.

l’ADN ligase Taq thermostable est également active à des températures plus élevées (37-75oC). La capacité d’effectuer une ligature à des températures élevées et la plus grande fidélité des ligases D’ADN Taq réduisent l’incidence de L’ADN recombinant inadéquat. Mais notez que cette enzyme ne peut ligaturer que les entailles et non les extrémités émoussées ou cohésives.,

la ligature sélective des entailles par Taq ADN ligase en fait la solution parfaite pour les techniques où seules les entailles doivent être ligaturées et la ligature finale doit être supprimée, telles que certaines méthodes d’assemblage de L’ADN. Il existe de nombreuses applications qui utilisent la ligature haute fidélité des entailles par Taq ADN ligase, y compris pour la détection et la quantification des polymorphismes nucléotidiques simples.

aperçu des applications de Ligase

bien que L’ADN ligase T4 puisse être la ligase de choix pour de nombreuses applications de biologie moléculaire, ce n’est pas toujours la meilleure ligase pour le travail., Pour un aperçu rapide des caractéristiques des différentes ligases, consultez notre tableau de recherche rapide ci-dessous.

Keeping the above points in mind, it shouldn’t be difficult to choose a DNA ligase for your next ligation application!, Utilisez – vous une ligase autre que T4? Laissez un commentaire ci-dessous.

pour en savoir plus

ADN Ligase, T4. Dans Le Manuel Des Enzymes Worthington. Worthington Biochimiques De La Société. (2019).

Shuman, S. DNA Ligases: progrès et perspectives. JBC. 284(26);17365–9 (2009). DOI 10.1074 / jbc.R900017200

tableau de sélection des ligases à base de substrat. Nouvelle-Angleterre Biolabs.

tableau de sélection de L’ADN Ligase. Nouvelle-Angleterre Biolabs.

Lehnman, I. R.. ADN Ligase: Structure, mécanisme et fonction. La Science, 186(4166);790-797 (1974). DOI: 10.1126 / science.186.4166.,790

spécificité du substrat et discrimination de discordance dans les ligases D’ADN. New England Biolabs