Un gel d’agarose avec des bandes d’ADN marqués avec du bromure d’éthidium et visualisées sous lumière UV sur un Transilluminateur UV.
L’Agarose est une matrice préférée pour travailler avec des protéines et des acides nucléiques, car il présente une large gamme de stabilité physique, chimique et thermique, et son degré de complexité chimique plus faible le rend également moins susceptible d’interagir avec les biomolécules. L’Agarose est le plus couramment utilisé comme milieu pour la séparation électrophorétique à l’échelle analytique dans l’électrophorèse sur gel d’agarose., Les Gels fabriqués à partir d’agarose purifié ont une taille de pores relativement importante, ce qui les rend utiles pour la séparation de grosses molécules, telles que des protéines et des complexes protéiques >200 kilodaltons, ainsi que des fragments D’ADN >100 paires de base. L’Agarose est également largement utilisé pour un certain nombre d’autres applications, par exemple l’immunodiffusion et l’immunoélectrophorèse, car les fibres d’agarose fonctionnent comme un point d’ancrage pour les immunocomplexes.,
électrophorèse sur gel D’Agarosemodifier
l’électrophorèse sur gel D’Agarose est la méthode de routine pour résoudre l’ADN en laboratoire. Les gels d’Agarose ont un pouvoir de résolution plus faible pour L’ADN que les gels d’acrylamide, mais ils ont une plus grande plage de séparation,et sont donc généralement utilisés pour les fragments d’ADN avec des longueurs de 50-20, 000 PB (paires de bases), bien qu’une résolution de plus de 6 Mo soit possible avec, Il peut également être utilisé pour séparer de grandes molécules de protéines, et c’est la matrice préférée pour l’électrophorèse sur gel de particules avec des rayons efficaces supérieurs à 5-10 nm.
La taille des pores du gel affecte la taille de l’ADN qui peut être tamisé. Plus la concentration du gel est faible, plus la taille des pores est grande et plus l’ADN qui peut être tamisé est grand. Cependant, les gels à faible concentration (0,1-0,2%) sont fragiles et donc difficiles à manipuler, et l’électrophorèse des grosses molécules D’ADN peut prendre plusieurs jours. La limite de résolution pour l’électrophorèse sur gel d’agarose standard est d’environ 750 kb., Cette limite peut être surmontée par PFGE, où des champs électriques orthogonaux alternatifs sont appliqués au gel. Les fragments D’ADN se réorientent lorsque le champ appliqué change de direction, mais les molécules d’ADN plus grandes prennent plus de temps à se réaligner lorsque le champ électrique est modifié, tandis que pour les plus petits, il est plus rapide, et l’ADN peut donc être fractionné en fonction de la taille.
les gels d’Agarose sont coulés dans des moules, et quand ensemble, généralement horizontale immergé dans une solution tampon., Les tampons TRIS-acétate-EDTA et tris-Borate-EDTA sont couramment utilisés, mais d’autres tampons tels que le TRIS-phosphate, le barbiturique acide-sodium barbiturique ou les tampons Tris-barbiturique peuvent être utilisés dans d’autres applications. L’ADN est normalement visualisé par coloration avec du bromure d’éthidium, puis vu sous une lumière UV, mais d’autres méthodes de coloration sont disponibles, telles que le vert SYBR, le GelRed, le bleu de méthylène et le violet cristallin. Si les fragments d’ADN séparés sont nécessaires pour une expérience ultérieure en aval, ils peuvent être découpés du gel en tranches pour une manipulation ultérieure.,
colonnes de filtration de gel à base D’Agarose utilisées pour la purification des protéines sur une machine AKTA FPLC.
Protein purificationEdit
la matrice de gel D’Agarose est souvent utilisée pour la purification des protéines, par exemple, dans la séparation à l’échelle préparative à base de colonnes comme dans la chromatographie de filtration sur gel, la chromatographie d’affinité et la chromatographie d’échange d’ions. Il n’est cependant pas utilisé comme gel continu, mais plutôt sous forme de billes poreuses ou de résines de finesse variable., Les perles sont très poreuses de sorte que la protéine peut circuler librement à travers les perles. Ces billes à base d’agarose sont généralement molles et facilement broyées, elles doivent donc être utilisées dans des procédures de gravité, de centrifugation à basse vitesse ou de basse pression. La résistance des résines peut être améliorée par une réticulation accrue et un durcissement chimique des résines d’agarose, mais de tels changements peuvent également entraîner une capacité de liaison inférieure pour les protéines dans certaines procédures de séparation telles que la chromatographie d’affinité.,
L’Agarose est un matériau utile pour la chromatographie car il n’absorbe pas les biomolécules dans une mesure significative, possède de bonnes propriétés d’écoulement et peut tolérer des pH extrêmes et une résistance ionique ainsi qu’une concentration élevée de dénaturants tels que l’urée 8M ou le HCl de guanidine 6M. Des exemples de matrice à base d’agarose pour la chromatographie de filtration sur gel sont Sepharose et WorkBeads 40 SEC (agarose perlé réticulé), Praesto et Superose (agaroses perlées fortement réticulées), et Superdex (dextran lié de manière covalente à l’agarose).,
pour la chromatographie d’affinité, l’agarose perlée est la résine matricielle la plus couramment utilisée pour la fixation des ligands qui lient les protéines. Les ligands sont liés de manière covalente à travers une entretoise à des groupes hydroxyles activés de polymère de billes d’agarose. Les protéines d’intérêt peuvent alors être liées sélectivement aux ligands pour les séparer des autres protéines, après quoi elles peuvent être éluées. Les billes d’agarose utilisées ont généralement des densités de 4% et 6% avec une capacité de liaison élevée pour les protéines.,
milieu de culture solide
la plaque D’Agarose peut parfois être utilisée à la place de la gélose pour la culture d’organismes, car la gélose peut contenir des impuretés pouvant affecter la croissance de l’organisme ou certaines procédures en aval telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR). L’Agarose est également plus dur que l’agar et peut donc être préférable lorsqu’une plus grande résistance au gel est nécessaire, et sa température de gélification plus basse peut empêcher de provoquer un choc thermique à l’organisme lorsque les cellules sont en suspension dans un liquide avant la gélification., Il peut être utilisé pour la culture de bactéries autotrophes strictes, de protoplastes végétaux, de Caenorhabditis elegans, d’autres organismes et de diverses lignées cellulaires.
3D Cell culturedit
L’Agarose est souvent utilisé comme support pour la culture tridimensionnelle de cellules humaines et animales. Parce que l’agarose forme des hydrogels non cytotoxiques, il peut être utilisé pour reproduire l’environnement naturel des cellules du corps humain, la matrice extracellulaire. Cependant, l’agarose forme un hydrogel inerte rigide qui ne porte aucune information biologique, de sorte que les cellules humaines et animales ne peuvent pas adhérer au polysaccharide., En raison de ces propriétés spécifiques, l’hydrogel d’agarose imite l’environnement naturel des cellules cartilagineuses et soutient la différenciation des chondrocytes en cartilage. Afin de modifier les propriétés mécaniques de l’agarose pour reproduire l’environnement naturel d’autres cellules humaines, l’agarose peut être modifié chimiquement par l’oxydation précise de l’alcool primaire du D-galactose en acide carboxylique. Cette modification chimique fournit une nouvelle classe de matériaux appelée agarose carboxylée., Grâce au contrôle du nombre de D-galactose carboxylé sur le squelette polysaccharidique, les propriétés mécaniques de l’hydrogel résultant peuvent être contrôlées avec précision. Ces hydrogels d’agarose carboxylés peuvent ensuite se lier de manière covalente aux peptides pour former de l’hydrogel sur lequel les cellules peuvent adhérer. Il a été démontré que ces hydrogels d’agarose carboxylés dirigent l’organisation des cellules endothéliales humaines en lumens polarisés.Le mélange d’agarose entièrement carboxylé avec de l’agarose naturel peut être utilisé pour fabriquer des hydrogels qui couvrent toute une gamme de propriétés mécaniques.,
motilité assaysEdit
L’Agarose est parfois utilisé à la place de la gélose pour mesurer la motilité et la mobilité des micro-organismes. Les espèces mobiles pourront migrer, quoique lentement, à travers le gel poreux et les taux d’infiltration pourront alors être visualisés. La porosité du gel est directement liée à la concentration d’agar ou d’agarose dans le milieu, de sorte que différents gels de concentration peuvent être utilisés pour évaluer la motilité de la nage, de l’essaimage, du glissement et des contractions d’une cellule. Le test de migration des cellules sous-agarose peut être utilisé pour mesurer la chimiotaxie et la chimiokinèse., Une couche de gel d’agarose est placée entre une population cellulaire et un chimioattractant. À mesure qu’un gradient de concentration se développe à partir de la diffusion du chimioattractant dans le gel, diverses populations cellulaires nécessitant différents niveaux de stimulation pour migrer peuvent ensuite être visualisées au fil du temps à l’aide de la microphotographie alors qu’elles creusent un tunnel vers le haut à travers le gel contre la gravité le long du gradient.
