un gel de agarosa con bandas de ADN teñidas con bromuro de etidio y visualizadas bajo luz UV en un Transiluminador UV.
la agarosa es una matriz preferida para trabajar con proteínas y ácidos nucleicos, ya que tiene una amplia gama de estabilidad física, química y térmica, y su menor grado de complejidad química también la hace menos propensa a interactuar con biomoléculas. La agarosa se usa más comúnmente como medio para la separación electroforética a escala analítica en la electroforesis en gel de agarosa., Los geles hechos de agarosa purificada tienen un tamaño de poro relativamente grande, lo que los hace útiles para la separación de moléculas grandes, como proteínas y complejos de proteínas >200 kilodaltons, así como fragmentos de ADN >100 pares de base. La agarosa también se usa ampliamente para varias otras aplicaciones, por ejemplo, inmunodifusión e inmunoelectroforesis, ya que las fibras de agarosa funcionan como un ancla para inmunocomplejos.,
electroforesis en gel de Agarosaeditar
la electroforesis en gel de agarosa es el método de rutina para resolver el ADN en el laboratorio. Los geles de agarosa tienen menor poder de resolución para el ADN que los geles de acrilamida, pero tienen un mayor rango de separación,y por lo tanto se utilizan generalmente para fragmentos de ADN con longitudes de 50-20, 000 bp (pares de bases), aunque la resolución de más de 6 Mb es posible con electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE)., También se puede usar para separar moléculas de proteínas grandes, y es la matriz preferida para la electroforesis en gel de partículas con radios efectivos mayores de 5-10 nm.
el tamaño del poro del gel afecta al tamaño del ADN que se puede tamizar. Cuanto menor sea la concentración del gel, mayor será el tamaño de los poros y mayor será el ADN que se puede tamizar. Sin embargo, los geles de baja Concentración (0.1-0.2%) son frágiles y, por lo tanto, difíciles de manejar, y la electroforesis de moléculas de ADN grandes puede tardar varios días. El límite de resolución para la electroforesis en gel de agarosa estándar es de alrededor de 750 kb., Este límite puede ser superado por PFGE, donde se aplican campos eléctricos ortogonales alternos al gel. Los fragmentos de ADN se reorientan cuando el campo aplicado cambia de dirección, pero las moléculas más grandes de ADN tardan más en realinearse cuando el campo eléctrico se altera, mientras que para las más pequeñas es más rápido, y el ADN puede por lo tanto ser fraccionado de acuerdo al tamaño.
Los geles de agarosa se echan en un molde, y cuando se fijan, funcionan generalmente horizontalmente sumergidos en una solución del almacenador intermediario., Los tampones Tris-acetato-EDTA y Tris-borato-EDTA se usan comúnmente, pero otros tampones como Tris-fosfato, barbitúrico ácido-sodio barbitúrico o tampones Tris-barbitúricos se pueden usar en otras aplicaciones. El ADN se visualiza normalmente por tinción con bromuro de etidio y luego se ve bajo una luz UV, pero otros métodos de tinción están disponibles, como el verde SYBR, GelRed, azul de metileno y violeta de cristal. Si los fragmentos de ADN separados son necesarios para un experimento posterior, se pueden cortar del gel en rodajas para una mayor manipulación.,
columnas de filtración de gel a base de agarosa utilizadas para la purificación de proteínas en una máquina AKTA FPLC.
purificación de Proteíaeditar
la matriz de gel de agarosa se usa a menudo para la purificación de proteínas, por ejemplo, en la separación de escala preparativa basada en columnas como en la cromatografía de filtración de gel, cromatografía de afinidad y cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, no se utiliza como un gel continuo, sino que se forma en perlas porosas o resinas de finura variable., Las perlas son altamente porosas para que la proteína pueda fluir libremente a través de las perlas. Estas perlas a base de agarosa son generalmente suaves y fácilmente trituradas, por lo que deben usarse bajo procedimientos de flujo por gravedad, centrifugación de baja velocidad o baja presión. La resistencia de las resinas se puede mejorar mediante el aumento de la reticulación y el endurecimiento químico de las resinas de agarosa, sin embargo, tales cambios también pueden resultar en una menor capacidad de unión de proteínas en algunos procedimientos de separación como la cromatografía de afinidad.,
la agarosa es un material útil para la cromatografía porque no absorbe biomoléculas en ninguna medida significativa, tiene buenas propiedades de flujo y puede tolerar extremos de pH y fuerza iónica, así como alta concentración de desnaturalizantes como urea de 8 m o ácido clorhídrico de guanidina de 6 m. Ejemplos de matriz basada en agarosa para la cromatografía de filtración de gel son Sefarosa y cabezales de trabajo 40 seg (agarosa con cuentas reticuladas), Praesto y Superosa (agarosas con cuentas altamente reticuladas) y Superdex (dextrano covalentemente vinculado a la agarosa).,
para la cromatografía de afinidad, la agarosa moldeada es la resina de matriz más comúnmente utilizada para la Unión de los ligandos que se unen a la proteína. Los ligandos están unidos covalentemente a través de un espaciador a grupos hidroxilo activados de polímero de grano de agarosa. Las proteínas de interés pueden entonces ser selectivamente unidas a los ligandos para separarlas de otras proteínas, después de lo cual pueden ser eluidas. Las perlas de agarosa utilizadas son típicamente de 4% y 6% de densidades con una alta capacidad de unión de proteínas.,
medio de cultivo Sólidoeditar
La placa de agarosa a veces se puede usar en lugar de agar para cultivar organismos, ya que el agar puede contener impurezas que pueden afectar el crecimiento del organismo o algunos procedimientos posteriores, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La agarosa también es más dura que el agar y, por lo tanto, puede ser preferible cuando se necesita una mayor resistencia al gel, y su menor temperatura de gelificación puede evitar causar un choque térmico al organismo cuando las células están suspendidas en líquido antes de la gelificación., Se puede utilizar para el cultivo de bacterias autotróficas estrictas, protoplastos vegetales, Caenorhabditis elegans, otros organismos y varias líneas celulares.
cultura celular 3DEDITAR
la agarosa se usa a menudo como soporte para el cultivo tridimensional de células humanas y animales. Debido a que la agarosa forma hidrogeles no citotóxicos, se puede utilizar para reproducir el entorno natural de las células en el cuerpo humano, la matriz extracelular. Sin embargo, la agarosa forma un hidrogel inerte rígido que no lleva ninguna información biológica, por lo que las células humanas y animales no pueden adherirse al polisacárido., Debido a estas propiedades específicas, el hidrogel de agarosa imita el entorno natural de las células del cartílago y se ha demostrado que apoya la diferenciación de los condrocitos en cartílago. Con el fin de modificar las propiedades mecánicas de la agarosa para reproducir el entorno natural de otras células humanas, la agarosa puede modificarse químicamente a través de la oxidación precisa del alcohol primario de la D-galactosa en ácido carboxílico. Esta modificación química proporciona una nueva clase de materiales llamados agarosa carboxilada., A través del control sobre el número de D-galactosa carboxilada en la columna vertebral del polisacárido, las propiedades mecánicas del hidrogel resultante se pueden controlar con precisión. Estos hidrogeles de agarosa carboxilada se pueden unir covalentemente a péptidos para formar hidrogel en el que las células pueden adherirse. Se ha demostrado que estos hidrogeles de agarosa carboxilados dirigen la organización de las células endoteliales humanas en lúmenes polarizados.La mezcla de agarosa completamente carboxilada con agarosa natural se puede utilizar para hacer hidrogeles que abarcan toda una gama de propiedades mecánicas.,
ensayos de Motilidadeditar
la agarosa a veces se usa en lugar del agar para medir la motilidad y la movilidad de los microorganismos. Las especies móviles podrán migrar, aunque lentamente, a través del gel poroso y las tasas de infiltración se pueden visualizar. La porosidad del gel está directamente relacionada con la concentración de agar o agarosa en el medio, por lo que se pueden usar diferentes geles de concentración para evaluar la motilidad de una célula que nada, enjambra, se desliza y se contrae. El ensayo de migración celular bajo-agarosa se puede utilizar para medir la quimiotaxis y la quimiocinesis., Se coloca una capa de gel de agarosa entre una población celular y un quimioatrayente. A medida que se desarrolla un gradiente de concentración a partir de la difusión del quimioatrayente en el gel, varias poblaciones celulares que requieren diferentes niveles de estimulación para migrar pueden visualizarse con el tiempo utilizando la microfotografía a medida que avanzan a través del gel contra la gravedad a lo largo del gradiente.
