Gli enzimi che catalizzano l’ubiquitinazione del fosfo-IkB sono costitutivamente attivi. Quindi, l’unico passo regolato che detta il destino di IkB e NF-kB è nella maggior parte dei casi la fosforilazione delle due serine N-terminali nella molecola IkB. Poiché il complesso E3IkB può anche essere coinvolto nella degradazione di CD4 e β-catenina, la fase di fosforilazione è anche quella che fornisce specificità a questa via di segnalazione., Ci sono solo due eccezioni a questo percorso universale per l’attivazione di NF-kB. Il primo è l’attivazione di NF-kB in risposta alla radiazione UV, che sebbene dipenda dalla degradazione di IkB non coinvolge la fosforilazione di IkB N-terminale (Bender et al., 1998; Li e Karin, 1998). La seconda eccezione è l’anossia, che stimola la fosforilazione di IkBa a tirosina 42 (Imbert et al., 1996). È stato suggerito che la tirosina fosforilata IkBa si leghi al dominio SH2 della chinasi PI3, che la allontana da NF-kB (Beraud et al., 1999)., Questo residuo della tirosina alla posizione 42 di IkBa, tuttavia, non è conservato in altre proteine di IkB e quindi l’universalità di questa via è discutibile. Il controllo della fosforilazione IkB in risposta a tutti gli altri stimoli attivanti NF-kB poggia sulle spalle del complesso IKB chinasi (IKK).
Una volta che è diventato chiaro che l’evento chiave nell’attivazione di NF-kB era la fosforilazione di IkB, il passo logico successivo era cercare una chinasi IKB sensibile allo stimolo (IKK) che potesse catalizzare questo evento., Questo sforzo ha dato i suoi frutti tre anni fa, quando è stata identificata una protein chinasi che fosforila specificamente le serine regolatorie N-terminali di IkBs e la cui attività è stata notevolmente stimolata dal TNFa (DiDonato et al., 1997; Mercurio et al., 1997). Questa attività di IKK è stata indicata per essere serina-specifica e rispondente ad una serie di attivatori potenti di NF-kB oltre a TNFa, che stimolano la sua attività con cinetiche che corrispondono a quelle di degradazione di IkBa (DiDonato et al., 1997). La misura in cui IKK è attivato da un dato stimolo sembra dettare la cinetica della degradazione di IkB., Esperimenti di filtrazione gel hanno suggerito che IKK è un complesso proteico e infatti, purificazione di proteine, microsequencing e clonazione molecolare hanno finora portato all’identificazione di tre polipeptidi IKK strettamente associati. Due di questi polipeptidi, IKKa (chiamato anche IKK1) e IKKß (IKK2) servono come subunità catalitiche della chinasi (DiDonato et al., 1997; Mercurio et al., 1997; Zandi et al., 1997, 1998), mentre il terzo polipeptide, IKKy (noto anche come NEMO o IKKAP1), funge da subunità regolatrice (Mercurio et al., 1999; Rothwarf et al., 1998; Yamaoka et al., 1998).,
IKKa è stata anche isolata attraverso uno schermo a due ibridi come proteina che interagisce con la chinasi chinasi chinasi MAP (MAP3K), NIK (NF-kB inducing chinase) (Régnier et al., 1997). Sebbene negli esperimenti di sovraespressione nelle cellule di coltura tissutale, NIK agisce come un potente attivatore sia di IKK che di NF-kB (Karin e Delhase, 1998; Malinin et al., 1997; Régnier et al., 1997; Woronicz et al., 1997), recenti esperimenti mettono in discussione il suo coinvolgimento nell’attivazione di IKK da parte di TNFa o IL-1 (Baud et al., 1999)., A sostegno di questi risultati basati su esperimenti di trasfezione transitoria, è stato recentemente scoperto che la mutazione aly del topo, che si traduce in perdita di organi linfoidi, è una mutazione puntuale nel gene che codifica per NIK (Shinkura et al., 1999). L’analisi delle cellule derivate da topi aly indica che l’IL-1 e l’attivazione mediata da TNFa di NF-kB sono normali. Poiché l’aspetto fenotipico dei topi aly è simile a quello dei topi carenti di linfotossina (LT) (Shinkura et al., 1999), è probabile che NIK funzioni come mediatore della segnalazione LT e non abbia alcun ruolo nella segnalazione TNFa o IL-1., Sebbene un’interazione tra NIK e IKKa sia stata rilevata nelle cellule di lievito o in seguito a sovraespressione delle due chinasi nelle cellule di mammifero, finora non è stata rilevata in condizioni fisiologiche. Inoltre la subunità IKKa, che è stata proposta come obiettivo preferenziale per NIK (Ling et al., 1998), non è direttamente coinvolto nell’attivazione di IKK (Delhase et al., 1999; Hu et al., 1999).,
IKKa e IKKß hanno strutture primarie molto simili (52% di identità complessiva) e contengono domini protein chinasi nei loro N termini, e chiusure lampo leucina (LZ) e motivi helix – loop – helix (HLH) nelle loro porzioni C-terminali (Figura 2). IKKy non contiene un dominio catalitico riconoscibile, ma è composto principalmente da tre grandi regioni α-elicoidali, tra cui un LZ (Figura 2). L’analisi biochimica di due linee cellulari umane indica che la forma predominante di IKK è un IKKa: IKKß eterodimero associato a un dimero o trimero di IKKy (Rothwarf et al., 1998)., Una quarta proteina, una proteina associata al complesso IKK chiamata IKAP, è stata proposta per essere coinvolta nell’attivazione di IKK (Cohen et al., 1998). Tuttavia, poiché IKAP non è un costituente facilmente rilevato del complesso IKK, il suo significato fisiologico e la sua funzione non sono ancora chiari. Inoltre, l’analisi delle sequenze suggerisce che IKAP è l’omologo umano di uno dei componenti del complesso “Elongatore” di allungamento trascrizionale del lievito (Otero et al., 1999). Quindi, IKAP è molto probabilmente una proteina nucleare e, quindi, è improbabile che serva come componente del complesso citoplasmatico IKK.,
I tre componenti della chinasi IkB (IKK). Sono indicati i principali motivi strutturali e funzionali di IKKa, IKKß e IKKy., Chinasi D, dominio della chinasi; LZ, cerniera di leucina; HLH, helix – loop – helix; α, α elicoidale regione in grado di formare coiled-coil
Come detto sopra, nativo di complessi di IKK purificato da cellule di mammifero finora sembrano essere montati solo da IKKa:IKKß eterodimeri più un numero indeterminato di IKKy subunità (Rothwarf et al., 1998). In vitro, IKKa e IKKß possono formare sia omo-che eterodimeri in un modo che dipende dall’integrità dei loro motivi LZ (Zandi et al., 1998)., È quindi possibile che IKKa: IKKß eterodimeri formino prima e poi interagiscano con IKKy, che media la formazione di un dimero di dimeri. Infatti, nelle cellule deficienti di IKKy, IKKa e IKKß sono presenti in un complesso di 300 kDa rispetto al grande complesso di 700 – 900 kDa presente nelle cellule wild-type (Yamaoka et al., 1998). Il piccolo complesso di 300 kDa viene rilevato anche quando IKKa o IKKß sono sovraespressi (Zandi et al., 1997) e la reticolazione indica che questo complesso è un dimero di IKKa e IKKß (Zandi et al., 1998).,
Se esaminate come proteine con epitopi marcati transitoriamente nelle cellule di mammifero, IKKa e IKKß presentano cinetiche di attivazione identiche e specificità del substrato (Mercurio et al., 1997; Zandi et al., 1997). Tuttavia, è importante rendersi conto che, sebbene altamente riproducibili, tali esperimenti sono in qualche modo fuorvianti perché le proteine espresse transitoriamente si scambiano prontamente con le loro controparti endogene e sono incorporate nel grande complesso IKK (Zandi et al., 1997)., Pertanto, quando l’IKKA etichettata con epitopo viene precipitata e viene misurata la sua attività chinasica IkB associata, non è chiaro se si stia misurando l’attività della proteina IKKa esogena o le attività di IKKa o IKKß endogena con cui si associa. Anche mutanti cataliticamente inattivi di IKKa e IKKß sono stati trovati per associare una notevole quantità di attività inducibile citochina IKB chinasi su espressione transitoria (Zandi et al., 1997)., Tuttavia, una vasta sovraespressione di IKKA o IKKß cataliticamente inattivi può inibire l’attivazione di NF-kB in risposta a TNFa, come misurato dall’inibizione della traslocazione nucleare di RelA (Zandi et al., 1997).
Le attività chinasiche di IKKa e IKKß e le loro capacità di essere attivate dipendono dalla loro dimerizzazione mediata da LZ, e le mutazioni LZ che interferiscono con questo processo aboliscono l’attività chinasica IkB (Zandi et al., 1997, 1998). L’attività IKKa o IKKß è anche abolita da mutazioni all’interno del motivo HLH (Zandi et al., 1997, 1998)., Le mutazioni HLH, tuttavia, non interferiscono con la dimerizzazione o il legame con IKKy. Piuttosto, il motivo HLH sembra interagire con il dominio della chinasi e può stimolare la sua attività quando espresso in trans (Delhase et al., 1999).
L’attivazione di IKK dipende anche dalla presenza di una subunità IKKy intatta. Né l’attività di IKK né di NF-kB può essere provocata in cellule IKKy-carenti dopo il trattamento con TNFa, IL-1, endotossina o dsRNA (Yamaoka et al., 1998)., Inoltre, complessi IKK assemblati su un mutante troncamento di IKKy che manca il suo C-terminale LZ sono refrattari a tutti questi agonisti (Rothwarf et al., 1998). Questi risultati forniscono una prova genetica dell’importanza di IKK nell’attivazione di NF-kB e suggeriscono che la regione C-terminale di IKKy è necessaria per il reclutamento di attivatori a monte (presumibilmente IKK-chinasi o IKK-Ks). Inoltre, la sovraespressione di IKKy può inibire l’attivazione di IKK a causa della titolazione di limitanti attivatori IKK che rimangono da identificare (Li et al., 1999b).,
L’attivazione di IKK dipende dalla fosforilazione della sua subunità IKKß (Delhase et al., 1999). La prima evidenza di un ruolo per la fosforilazione nell’attivazione di IKK è stata ottenuta mediante trattamento di complesso IKK purificato e attivato con fosfatasi proteica 2A (PP2A), che ha portato all’inattivazione di IKK (DiDonato et al., 1997). Inoltre, il trattamento delle cellule con acido okadaico, un inibitore di PP2A, provoca una lenta attivazione di IKK (e di conseguenza NF-kB). Più recentemente, l’incubazione di cellule con TNFa ha dimostrato di stimolare la fosforilazione di tutte e tre le subunità IKK (Delhase et al., 1999)., IKKa e IKKß sono fosforilati esclusivamente a serine, mentre IKKy è fosforilato su serina e treonina. La posizione di queste serine è stata mappata biochimicamente solo per IKKß, ma si può presumere che i siti equivalenti siano anche fosforilati su IKKa. Due delle serine fosfo-accettore IKKß si trovano nel suo ciclo di attivazione (Delhase et al., 1999), una porzione del dominio della chinasi che è simile a una regione coinvolta nell’attivazione dipendente dalla fosforilazione di altre protein chinasi (Zheng e Guan, 1994)., Più frequentemente, la forma non fosforilata del ciclo di attivazione si ripiega sul dominio della chinasi e interferisce con l’ingresso di substrati ATP e peptidici nella tasca catalitica. La fosforilazione allontana il ciclo di attivazione dalla tasca catalitica, consentendo così l’ingresso e il legame dei substrati (Johnson et al., 1996). La sostituzione delle due serine fosfo-accettanti (S177 e S181) nell’anello T di IKKß con alanina impedisce la sua attivazione, mentre la loro sostituzione con residui di glutammato fosfo-mimetico causa l’attivazione costitutiva (Delhase et al., 1999; Mercurio et al., 1997)., È interessante notare che, tuttavia, la sostituzione delle serine equivalenti (S176 e S180) in IKKa abolisce l’autofosforilazione di IKKa ma non ha alcun effetto sulla stimolazione dell’attività totale di IKK associata al mutante IKKa(A176/A180) da parte di TNFa, IL-1 o delle chinasi a monte MEKK1 e NIK (Delhase et al., 1999). Questi risultati sono stati i primi a sottolineare le differenze funzionali tra le due subunità catalitiche, e questi risultati sono stati successivamente confermati dall’analisi genetica., Sulla base di questi risultati, IKK viene attivato in risposta a stimoli proinfiammatori attraverso la fosforilazione di IKKß; sebbene la fosforilazione di IKKa sia concomitante con quella di IKKß, non è essenziale per la stimolazione dell’attività della chinasi IkB. In altre parole, la subunità IKKß e non IKKa funge da bersaglio per gli attivatori a monte coinvolti nella segnalazione proinfiammatoria. Questi attivatori vengono reclutati nel complesso tramite la subunità IKKy, molto probabilmente attraverso l’interazione con il suo dominio C-terminale.
La fosforilazione può anche causare una regolazione negativa dell’attività IKK., Oltre al suo ciclo di attivazione, IKKß è ampiamente fosforilato all’interno di una regione situata tra il suo motivo HLH e il terminale C, che contiene più serine (Delhase et al., 1999). La fosforilazione di queste serine dipende dall’attività dell’autochinasi e presumibilmente si verifica in seguito alla fosforilazione del ciclo di attivazione. Gli esperimenti di mutagenesi indicano che i siti di autofosforilazione C-terminale sono coinvolti nella downregulation dell’attività chinasica (Delhase et al., 1999)., La sostituzione di nove o dieci delle serine C-terminali di IKKß con alanina produce un mutante che rimane attivo quattro volte più a lungo dell’enzima wild-type, mentre la sostituzione degli stessi siti con residui di acido glutammico fosfomimetico produce un enzima mutante che difficilmente può essere attivato. Sulla base di questi risultati, è stato proposto un modello in tre fasi per spiegare la regolazione dell’attività IKK (Figura 3; Delhase et al., 1999). Inizialmente, il complesso IKK inattivo non è fosforilato. In risposta agli stimoli a monte IKK-Ks vengono attivati e reclutati nel complesso IKK tramite la subunità IKKy., Ciò provoca la fosforilazione del ciclo di attivazione di IKKß e l’attivazione di IKK. È probabile che solo una piccola frazione di IKK sia inizialmente attivata attraverso la fosforilazione diretta da parte di IKK-Ks. Tuttavia, attraverso la trans-autofosforilazione la subunità IKKß attivata può fosforilare una subunità adiacente, che può essere IKKa o IKKß e altri complessi IKK inattivi attraverso una reazione intermolecolare., A sostegno di questa ipotesi, la semplice sovraespressione di IKKß nelle cellule di insetti Sf9 è sufficiente per la sua attivazione, e questa attivazione dipende assolutamente dalla sua autofosforilazione. I complessi IKK attivati quindi fosforilano le subunità IkB in NF-kB:complessi IkB, innescando la loro degradazione ubiquitina-dipendente e l’attivazione di NF-kB. Contemporaneamente e forse a causa della diminuzione dell’abbondanza di IkB, le subunità IKKß attivate (e presumibilmente anche le subunità IKKa) subiscono autofosforilazione C-terminale., Questa reazione, che è improbabile che sia processiva, ma potrebbe essere regolata dal livello di IkB, funziona come un dispositivo di temporizzazione tale che quando almeno nove delle serine C-terminali sono fosforilate l’enzima raggiunge uno stato di bassa attività. Una volta a questo stato, IKK diventa sensibile all’inattivazione da parte delle fosfatasi, specialmente una volta che il segnale a monte è scomparso., Poiché i siti di autofosforilazione C-terminale sono adiacenti al motivo HLH, possono esercitare il loro effetto negativo sull’attività della chinasi modificando la conformazione di questo dominio attivatore intrinseco della chinasi e influenzando la sua interazione con il dominio catalitico. Questa modalità di regolazione spiega perché IKK viene solitamente attivato in modo altamente transitorio.
Un modello in tre fasi per la regolazione dell’attività IKK mediante fosforilazione., Le due subunità catalitiche di IKK (IKKa e IKKß) si associano in un eterodimero tramite le loro cerniere a leucina (LZ). Nelle cellule non stimolate, il ciclo di attivazione all’interno del dominio della chinasi (KD) non è fosforilato e il motivo helix – loop – helix (HLH) contatta il dominio della chinasi. Anche il cluster di fosforilazione C-terminale non è fosforilato. Dopo la stimolazione cellulare con TNFa o IL-1, il ciclo di attivazione di IKKß viene fosforilato e attraverso la trans-autofosforilazione della seconda subunità (IKKa o IKKß, nel caso di un omodimero) IKK viene attivato., Una volta attivato, oltre alla fosforilazione di IkBs, IKK subisce una progressiva autofosforilazione nel suo cluster di serine C-terminale. Quando almeno nove delle serine C-terminali sono fosforilate, la repulsione elettrostatica altera l’interazione tra il motivo HLH attivante e il dominio della chinasi in modo tale che la chinasi raggiunga uno stato di bassa attività., In questo stato di IKK è probabile che siano più inclini a inibizione della fosfatasi azione
a Causa della capacità di IKKß propagare il suo stato attivo via autophosphorylation è importante disporre di un meccanismo per diminuire la sua attività chinasica e renderla sensibile all’inattivazione da una fosfatasi. Senza autoregolazione negativa, un singolo bolo di una citochina proinfiammatoria potrebbe provocare un’attivazione prolungata di IKK che porta ad un’attivazione prolungata di NF-kB seguita da un aumento della produzione di mediatori infiammatori sia primari che secondari., Poiché questi mediatori possono causare un’ulteriore attivazione di NF-kB (Barnes e Karin, 1997), esiste un rischio reale che in assenza di efficaci meccanismi di feedback negativo anche un insulto proinfiammatorio minore provochi una grave catastrofe, come lo shock settico.
È interessante notare che, tuttavia, l’attivazione costitutiva di IKK può verificarsi in stati patogeni ed è stata recentemente documentata nelle cellule della malattia di Hodgkin (Krappmann et al., 1999; recensito in Rayet e Gélinas, 1999, questo numero) e in cellule T infette da HTLV-1 (Uhlik et al., 1998; recensito in Sun and Ballard, 1999, questo numero)., Sebbene le basi molecolari per queste alterazioni nel comportamento IKK siano sconosciute, l’attivazione costitutiva NF-kB che ne consegue protegge queste cellule dall’induzione dell’apoptosi mediante radio – e chemoterapia (Bargou et al., 1997). Infatti, un’elevata attività NF-kB e IKK può proteggere numerosi tipi di tumori dalle terapie che inducono l’apoptosi (Gilmore, 1997). Pertanto, IKK è un obiettivo attraente per lo sviluppo di nuovi farmaci antitumorali. Tuttavia, come verrà discusso di seguito, la completa inibizione dell’attività di IKK può provocare effetti collaterali indesiderati.
