Riarrangiamenti ricorrenti di inversione del DNA nel genoma umano

Risultati

Motivazioni per l’analisi della dinamica del genoma umano.

Per studiare le dinamiche del genoma umano, abbiamo mirato alla rilevazione dei breakpoint di riarrangiamento cromosomico. Ciò richiede la disponibilità di una sequenza genomica di riferimento di altissima qualità. L’attuale sequenza del genoma umano soddisfa tali standard di qualità, contenendo poche lacune con un tasso di errore stimato molto basso (26)., Per questo studio, il National Center for Biotechnology Information (NCBI) Costruire 36 versione della sequenza del genoma di riferimento umano è stato utilizzato.

Per identificare potenziali siti per NAHR, la sequenza del genoma umano di riferimento è stata analizzata per la prima volta per trovare regioni cromosomiche di elevata identità di sequenza. Se si verificasse un evento di ricombinazione mediato da NAHR, ci si aspetterebbe che si formassero nuove strutture genomiche., Inoltre, se questi eventi si sono verificati nelle cellule somatiche, allora queste nuove strutture genomiche sarebbero previste presenti in una frazione molto piccola delle cellule totali analizzate, con la stragrande maggioranza delle cellule contenenti la corrispondente struttura genomica non organizzata (qui indicata come strutture wild-type). La prova di ciò può essere trovata in altri organismi, come i batteri (24, 25). Quindi, per identificare tali riarrangiamenti cromosomici, è necessaria una procedura sperimentale molto sensibile e specifica., A nostro avviso, al momento attuale, la tecnica di scelta per questo tipo di studio sarebbe un saggio basato sulla PCR utilizzando primer oligonucleotidici opportunamente definiti.

Il presente studio è focalizzato su inversioni di DNA derivate da eventi NAHR tra coppie di sequenze ripetute situate in orientamento inverso che possono generare inversioni di DNA. Lo schema presentato in Fig. 1 A esemplifica una coppia di strutture wild-type, indicate come a e b, e il corrispondente riarrangiamento di inversione che può essere prodotto da NAHR (Fig. 1 B), insieme ai primer PCR necessari per rilevare le diverse strutture., I primer devono corrispondere alle regioni prossimali, anche se esterne, alle ripetizioni. Se per il test PCR vengono utilizzati primer avanti e indietro che fiancheggiano una delle ripetizioni, viene rilevata la corrispondente struttura wild-type (Fig. 1 Bis). Un breakpoint di inversione può essere rilevato utilizzando entrambi i primer forward (Fa e Fb) o entrambi i primer reverse (Ra e Rb) (Fig. 1 B). In base alla posizione dei primer corrispondenti nella sequenza nucleotidica, è possibile calcolare la dimensione esatta del frammento PCR previsto.

Selezione di sequenze ripetute per analizzare la dinamica del genoma.

Le regioni genomiche da studiare sono state selezionate con una procedura bioinformatica multistep schematizzata in Fig. 2., Il primo passo consisteva nell’identificazione di tutte le coppie di sequenze invertite intracromosomiali formate da due nuclei, a e b, di almeno 400 nucleotidi di lunghezza che condividevano il 100% dell’identità della sequenza (vedi Materiali e metodi). Queste coppie di sequenze sono qui indicate come potenziali sequenze invertite ricombinogene (PRIS) (Fig. 2 Bis). Un totale di 24.547 PRI sono stati trovati nella Build NCBI 36 del genoma umano di riferimento. I PRI sono distribuiti tra tutti i 24 cromosomi diversi, e i nuclei che comprendono questi PRI variavano in lunghezza da 400 a 74.868 nucleotidi., Il numero totale di nucleotidi presenti nel PRIS non ridondante era 31.115.694 bp, rappresentando ≈1% del genoma umano. Successivamente abbiamo limitato la nostra ricerca a PRIS formati da nuclei di lunghezza inferiore a 4 kb e, quindi, che potrebbero essere efficacemente amplificati da metodologie PCR standard (n = 24.001; Fig. 2 B), seguito da un ulteriore criterio di ricerca arbitrario per cui la distanza che separa i nuclei corrispondenti di un PRIS era compresa tra 4 kb e 100 kb (n = 1.442; Fig. 2 C). La distribuzione genomica di questo insieme di PRIS è mostrata in Fig. 3.

Per progettare primer appropriati che fiancheggiano i due nuclei del PRIS corrispondente, è indispensabile la presenza di zone di sequenza di DNA “unica” a monte e a valle di ciascun nucleo. Ci riferiamo qui alla sequenza di DNA “unica” come uno rispetto ai confini corrispondenti di ciascun nucleo del PRIS e non all’intero genoma., È importante sottolineare che la maggior parte dei nuclei sono effettivamente immersi in regioni omologhe più grandi che presentano un’elevata identità, solitamente denominate duplicazioni segmentali (22). Abbiamo determinato il grado di identità della sequenza nelle regioni adiacenti ai nuclei corrispondenti di ciascuno dei PRIS mediante allineamento globale (vedi Materiali e metodi) della sequenza di DNA di ciascun nucleo esteso 2 kb a monte e 2 kb a valle. L’analisi dei 1.442 allineamenti ha determinato che solo 76 PRI contengono zone di sequenza di DNA “unica” (Fig. 2 D).,

Inoltre, la presenza di sequenze di DNA reiterate in altre posizioni del genoma potrebbe compromettere le prestazioni dei corrispondenti primer PCR. Gli elementi reiterati più importanti del genoma umano sono le cosiddette ripetizioni comuni. Queste ripetizioni includono ripetizioni tandem semplici e a bassa complessità, come microsatelliti e minisatelliti, elementi nucleari intervallati corti e lunghi, trasposoni del DNA e RNA ribosomiali e di trasferimento, tra gli altri. È stata determinata la presenza di ripetizioni comuni nei bordi di ciascun nucleo del 75 PRIS (vedi Materiali e metodi)., Sono stati selezionati solo quelli che presentano almeno 200 bp di sequenza di DNA “unica” priva di ripetizioni comuni in entrambi i bordi di ciascun PRI. Questa selezione ha portato a una serie di 35 PRI lavorabili (Fig. 2 E).,

In sintesi, in base alle diverse restrizioni imposte nel presente studio, ogni lavorabile PRIS è formato da due nuclei a e b, di intrachromosomal invertito le sequenze di DNA di condivisione al 100% di identità, con una dimensione che va da 400 a 4.000 nucleotidi, situato a una distanza tra i 4 kb e 100 kb, e la presentazione di almeno 200 bp unica sequenza nelle zone situato a 2 kb a monte e 2 kb a valle di ogni core (vedi schema in Fig. 2 E). Questo set praticabile di PRIS è distribuito tra la maggior parte dei cromosomi ed è evidenziato in Fig., 3; le posizioni dei nuclei di ciascun PRIS, le loro dimensioni e la distanza tra loro sono elencate nella tabella 1 delle informazioni di supporto (SI).

Progettazione di primer validi per analizzare la dinamica del genoma.

Da questo set di PRIS lavorabili, abbiamo arbitrariamente selezionato 10 per progettare primer PCR. Dalla nostra esperienza con il metodo PCR per rilevare i riarrangiamenti nei genomi batterici, ci siamo resi conto che è importante progettare e testare diversi primer PCR che fiancheggiano ciascuna delle sequenze ripetute selezionate (24)., Di conseguenza, quattro primer anteriori sono stati progettati nella regione a monte e quattro primer inversi sono stati progettati nella regione a valle dei due nuclei, a e b, di ciascuno dei PRI selezionati. La progettazione di ciascun primer comprendeva l’analisi dei suoi potenziali siti di priming nell’intero genoma e la sua capacità di generare prodotti di PCR in silico se combinati con altri primer potenziali (vedere Materiali e metodi). Tutti i primer selezionati come in silico-valid erano altamente specifici per rilevare la corrispondente regione genomica., Inoltre, se combinati per rilevare il corrispondente riarrangiamento di inversione, non sono stati segnalati prodotti in silico.

Dai 10 PRI selezionati, potremmo progettare in primer PCR silico-validi per 8 di essi (Fig. 2 F). I corrispondenti 32 primer PCR di ciascuno degli otto PRI selezionati sono stati sintetizzati e testati sperimentalmente. Le 16 combinazioni di oligonucleotidi per rilevare ciascuno dei nuclei del set di otto PRI nella configurazione wild-type sono state utilizzate per prime PCR utilizzando un campione di DNA derivato da cellule del sangue come bersaglio., Sono stati accettati solo i primer che producono un singolo prodotto PCR delle dimensioni previste. Se i gel di elettroforesi per rilevare i prodotti PCR erano sovraccaricati, in alcuni casi sono state osservate deboli bande secondarie; questa situazione è stata considerata accettabile. Dai prodotti PCR accettabili abbiamo dedotto i primer PCR validi.

Per l’analisi dei breakpoint di inversione, abbiamo utilizzato il set di otto PRI con primer PCR validi. Ogni PRIS in questo set aveva almeno due primer forward e due reverse validi per ogni core (Fig. 2 G)., Tutte le combinazioni di primer validi sono stati utilizzati per cercare i punti di interruzione di inversione in ogni PRIS. È importante sottolineare che, a differenza delle reazioni che rilevano le strutture wild-type, le PCR primarie per rilevare il riarrangiamento dell’inversione di solito non producevano bande visibili dopo aver macchiato i gel con bromuro di etidio (vedi sotto). Questo risultato era atteso, perché il numero di cellule contenenti il riarrangiamento mirato dovrebbe essere altamente diluito nel campione in esame., Quindi, le PCR secondarie, di solito nidificate o eminestate, sono state eseguite utilizzando un’aliquota del prodotto della reazione primaria e tutte le possibili combinazioni di primer appropriati. Potenziali prove per un riarrangiamento (Fig. 2 H) è stato considerato quando la combinazione appropriata di primer ha prodotto un prodotto PCR della dimensione prevista del frammento riorganizzato e senza bande secondarie. Dagli otto PRIS analizzati, in sei casi abbiamo avuto chiare prove potenziali di riarrangiamenti di inversione., Per accertare che il prodotto PCR era un frammento ricombinante contenente le regioni corrispondenti adiacenti al nucleo a in un’estremità e al nucleo b nell’altra estremità (vedi sopra e Fig. 1), è stata ottenuta la sequenza nucleotidica dei bordi dei prodotti PCR. I frammenti selezionati presentavano una sequenza di DNA che corrispondeva a quella della regione invertita prevista. In alcuni casi, abbiamo rilevato piccole deviazioni dalla sequenza di riferimento che dovrebbero corrispondere a SNP o mutazioni (dati non mostrati)., I sei PRI che hanno mostrato prove di riarrangiamenti di inversione corrispondono ai numeri 5, 6, 7, 13, 22, e 27 nella tabella SI 1. Cinque di essi si trovano all’interno di geni umani noti; in due casi, i nuclei corrispondenti si sovrappongono agli esoni (PRIS 22 e 27), mentre negli altri tre, entrambi i nuclei sono contenuti all’interno dello stesso introne (PRIS 5, 6 e 13).

Montaggio di kit di riarrangiamento.

Per ulteriori esperimenti, abbiamo selezionato PRIS 27, situato sul cromosoma 19; PRIS 22, situato sul cromosoma 15; e PRIS 6, situato sul cromosoma 3., Questi PRI saranno qui indicati come regione invertita 1 (IR-1), 2 (IR-2) e 3 (IR-3), rispettivamente, e sono indicati in Fig. 3. Per ogni regione, abbiamo preparato una serie di primer che costituiscono un “kit di riarrangiamento” (RKit) (Tabella SI 2). Ogni RKit è composto da tutti i primer PCR necessari per eseguire le PCR primarie e secondarie per rilevare le seguenti strutture specifiche di ciascuna regione selezionata: il nucleo a, il nucleo b e la struttura ricombinante derivata dall’inversione., Un altro reagente di ciascun RKit contiene una coppia di primer per ottenere un frammento PCR della sequenza identica corrispondente ai nuclei; quando etichettato con radioattività, questo frammento può essere utilizzato come sonda di ibridazione per rilevare uno qualsiasi dei prodotti PCR corrispondenti alla regione specifica.

Come accennato in precedenza, per convalidare i frammenti corrispondenti ai riarrangiamenti di inversione, è stata determinata la sequenza nucleotidica dei bordi dei corrispondenti prodotti PCR., I prodotti di PCR ottenuti con i primer specifici inclusi nei RKIT corrispondenti delle regioni IR-1, IR-2 e IR-3 sono stati ulteriormente convalidati. Ogni prodotto PCR è stato clonato e i bordi degli inserti di tre plasmidi ricombinanti, che in tutti i casi mostravano la dimensione del frammento di DNA atteso, sono stati sequenziati (vedi Materiali e metodi)., Per tutti gli RKIT utilizzati in questo studio, la sequenza nucleotidica sia del prodotto PCR che dell’inserto dei cloni derivati da esso ha accertato la presenza dei bordi attesi dei punti di interruzione derivati dal corrispondente riarrangiamento di inversione. I reagenti degli RKIT sono presentati nella tabella SI 2. Un esempio dei prodotti PCR che rappresentano le diverse strutture di ciascuna delle regioni selezionate del genoma è mostrato in Fig. 4.

Caratteristiche delle regioni selezionate per rilevare i riarrangiamenti genomici.

Le regioni selezionate per analizzare il verificarsi di riarrangiamenti genomici sono schematizzate in Fig. 5., Vengono mostrate sia la struttura wild-type che quella derivata da un’inversione dovuta a NAHR dei corrispondenti nuclei identici.

I nuclei identici a e b della regione IR-1 sono frammenti di DNA di 941 bp separati da 36.925 bp. Il nucleo a contiene l’esone 7 e parte degli introni 6-7 e 7-8 del gene SAFB2; il nucleo b contiene l’esone 7 e parte degli introni 6-7 e 7-8 del gene SAFB (Fig. 5 Bis). I geni SAFB2 e SAFB sono geni paralogici trascritti nella direzione opposta. La funzione di questi geni è stata proposta per essere coinvolta nell’organizzazione della cromatina, nella regolazione trascrizionale, nello splicing dell’RNA e nella risposta allo stress (27). Come mostrato in Fig., 5 B, un riarrangiamento di inversione derivato da NAHR mediato dai due nuclei identici altererebbe la struttura dei due geni.

Nella regione IR-2, i nuclei identici sono tratti di DNA di 482 bp separati da 24.129 bp. Il nucleo a include l’esone 7 e parte dell’esone 6, così come l’introne 6-7 e parte dell’introne 7-8 del gene DUOX2 (Fig. 5 C). Il nucleo b include l’esone 8 e parte dell’esone 7, così come l’introne 7-8 e parte dell’introne 8-9 del gene DUOX1 (Fig. 5 C). Questi geni sono stati annotati come ossidasi NADPH e sono stati trovati per essere altamente espressi nelle cellule tiroidee (28)., Nella regione tra i geni DUOX2 e DUOX1, si trova un altro gene, NIP. Come nel caso di SAFB2 e SAFB, i geni DUOX2 e DUOX1 sono geni paralogici trascritti nella direzione opposta. Di conseguenza, l’inversione mediata da NAHR dei due nuclei identici (Fig. 5 D) altererebbe la struttura dei geni.

Nel caso della regione IR-3, i nuclei identici sono segmenti di DNA di 885 bp separati da 7.935 bp. Entrambi fanno parte di una struttura di ripetizione comune, una lunga ripetizione terminale, e si trovano nello stesso introne, introne 3, del gene RNF13 (Fig. 5 E)., Questo gene è stato annotato come proteina del dito dello zinco dell’anello; la sua funzione specifica non è stata determinata. L’inversione risultante da NAHR tra i due nuclei (Fig. 5 F) si tradurrebbe in una piccola alterazione della struttura genica, situata all’interno dell’introne 3, e presumibilmente non avrebbe rilevanza fisiologica.

Cinetica temporale del rilevamento di riarrangiamenti mediante PCR.

Utilizzando i reagenti di un RKit, sono state eseguite PCR per rilevare strutture wild-type o riorganizzate. Sono state eseguite entrambe le reazioni primarie e secondarie e le aliquote sono state analizzate a diversi cicli., Le aliquote sono state sottoposte ad elettroforesi su gel di agarosio e rivelate sia dalla colorazione al bromuro di etidio che dalle macchie meridionali ibridate contro una sonda radioattiva. Un esempio utilizzando regione IR-1 e un DNA bersaglio da cellule del sangue è presentato in Fig. 6.

Nella PCR che rivela la struttura wild-type, la colorazione al bromuro di etidio ha mostrato il frammento atteso dalla reazione primaria (Fig. 6 A), mentre la struttura corrispondente al punto di interruzione del riarrangiamento di inversione è stata rivelata solo fino alla reazione secondaria, in questo caso annidata (Fig. 6 C). Usando Southern blots, potremmo dimostrare che il frammento che rivela il punto di interruzione della struttura riorganizzata viene effettivamente prodotto nella reazione primaria (Fig. 6 D).,

La cinetica temporale della PCR potrebbe essere utilizzata come metodo semiquantitativo per stimare la proporzione relativa di strutture riorganizzate rispetto alle strutture wild-type. Tuttavia, questa tecnica è solo un’approssimazione, perché il raddoppio del prodotto PCR in ogni ciclo si ottiene solitamente nel caso di piccoli prodotti e in determinate condizioni specifiche, come quelle utilizzate per la PCR quantitativa. Per quantificare la proporzione relativa di riarrangiamenti in un campione di DNA, abbiamo deciso di utilizzare un metodo più affidabile basato sulla diluizione del DNA bersaglio (vedi sotto).,

Cinetica di diluizione del rilevamento di riarrangiamenti mediante PCR.

Quando il DNA bersaglio per una PCR viene diluito e la reazione viene innescata per rilevare una struttura wild-type, viene raggiunta una diluizione in cui non viene trovato alcun prodotto. Questa diluizione deve essere vicina ad una concentrazione di DNA bersaglio di circa un genoma aploide per reazione. Al contrario, se la reazione viene innescata per rilevare un riarrangiamento, la diluizione alla quale non viene trovato alcun prodotto deve essere proporzionale alla concentrazione relativa del rispettivo riarrangiamento nel campione di DNA. Un tipico esperimento è presentato in Fig., 7 utilizzando un campione di DNA da cellule del sangue come bersaglio. La struttura wild-type corrispondente al nucleo a della regione IR-1 ha dato PCR positive fino a una diluizione contenente ≈10 pg di DNA per reazione; ad una concentrazione di 3 pg per reazione, teoricamente leggermente inferiore a un genoma aploide per reazione, non è stato osservato alcun prodotto PCR (Fig. 7 Bis). Al contrario, quando la PCR è stata innescata per rilevare il punto di interruzione dell’inversione, la reazione contenente ≈3 ng era ancora positiva, mentre le reazioni contenenti 1 ng o meno erano tutte negative (Fig. 7 B).

È importante notare che, come previsto, alle diluizioni che presentano l’ultima reazione positiva o la prima negativa, alcune aliquote presentano reazioni positive e alcune negative. Questo risultato è illustrato in Fig. 7 C e D per PCR che rilevano il riarrangiamento di inversione. Da 24 aliquote della diluizione contenenti 3 ng di DNA bersaglio per reazione, 17 sono risultati positivi (Fig. 7 C)., Alla successiva diluizione, contenente 1 ng di DNA bersaglio per reazione, di 24 aliquote solo 3 hanno dato reazioni positive (Fig. 7 D). Nelle diluizioni contenenti 18 ng o più DNA bersaglio per reazione, tutte le aliquote hanno dato una reazione positiva, mentre nelle diluizioni contenenti < 1 ng, tutte le aliquote hanno dato reazioni negative (dati non mostrati)., La concentrazione relativa di DNA necessaria per produrre una reazione positiva che rileva il riarrangiamento, rispetto a quella necessaria per produrre una reazione positiva che rileva la struttura wild-type, è proporzionale alla concentrazione relativa di strutture riorganizzate rispetto a quelle wild-type nel DNA bersaglio.

Concentrazione relativa di strutture riorganizzate in diversi campioni di DNA derivato da cellule somatiche.

La strategia di diluizione sopra illustrata è stata utilizzata per rilevare la concentrazione relativa di breakpoint di riarrangiamento in campioni di DNA di individui non correlati., Il DNA è stato estratto da cellule del sangue di neonati (sangue del cordone ombelicale) o individui adulti (vedere Materiali e metodi). Per ogni campione di DNA, sono state utilizzate diverse aliquote da diverse diluizioni come bersagli per le PCR per rilevare sia il wild-type (core a) che la corrispondente struttura riorganizzata derivata da eventi di inversione delle regioni IR-1, IR-2 e IR-3. Sono state utilizzate diverse aliquote di diluizioni appropriate e è stata calcolata la concentrazione relativa di DNA bersaglio per produrre una reazione positiva rilevando il tipo selvaggio o la corrispondente struttura riorganizzata., Il rapporto tra la concentrazione di strutture wild-type rispetto a quella di strutture riorganizzate dei diversi DNA bersaglio è presentato in una scala logaritmica in Fig. 8.

Gli otto individui testati hanno presentato riarrangiamenti di inversione nelle tre regioni analizzate. Tuttavia, la concentrazione relativa dei riarrangiamenti variava sia tra i campioni che tra le regioni. Agli estremi, un campione neonato di DNA ha presentato ≈105 strutture wild-type per una struttura invertita nella regione IR-1 (individuo 6), mentre alcuni campioni adulti hanno presentato circa due strutture wild-type per una struttura invertita nella regione IR-3 (individui 1 e 3)., In tutti i campioni, la regione IR-3 ha presentato una maggiore concentrazione relativa di strutture riorganizzate rispetto alle regioni IR-1 e IR-2. La scoperta più sorprendente è stata che, per le tre regioni analizzate, il DNA isolato al momento della nascita conteneva una concentrazione significativamente inferiore di strutture riorganizzate rispetto a quella isolata da individui adulti. La differenza di valori medi tra i due gruppi è stata significativa per le tre regioni, IR-1 (P < 0.02), IR-2 (P < 0.001) e IR-3 (P < 0.,001), utilizzando un’analisi unidirezionale della varianza. Il rapporto tra i valori medi tra entrambi i gruppi era 17, 70 e 166 volte per le regioni IR-1, IR-2 e IR-3, rispettivamente.