Le ligasi del DNA, incluso lo strumento di biologia molecolare T4 DNA ligasi, sono enzimi che facilitano l’unione di filamenti di DNA catalizzando la formazione del legame fosfodiestere tra i gruppi 5’-PO4 e 3’-OH della spina dorsale del DNA. Negli organismi, la DNA ligasi svolge un ruolo importante nella riparazione delle rotture nel DNA introdotte durante la replicazione e il danno, garantendo così l’integrità delle informazioni genetiche.,
La scoperta delle DNA Ligasi
Dato il loro ruolo vitale nella riparazione e replicazione del DNA, l’attività della DNA ligasi nelle cellule è stata proposta per esistere anche prima della loro scoperta. Due osservazioni hanno stimolato la ricerca di DNA ligasi.
- Il verificarsi di ricombinazione genetica per rottura e ricongiungimento di molecole di DNA.
- La formazione di cerchi chiusi da DNA lineare dal batteriofago I dopo l’infezione.
Nel 1967, le ligasi del DNA furono scoperte indipendentemente dai laboratori Gellert, Lehman, Richardson e Hurwitz., Dalla loro scoperta, le ligasi del DNA sono diventate strumenti importanti nella biologia molecolare. Le ligasi del DNA sono utilizzate nella clonazione molecolare per unire i frammenti del DNA insieme per creare il DNA ricombinante, come quando un pezzo di DNA estraneo è inserito in un plasmide.
La maggior parte delle reazioni di legatura coinvolgono frammenti di DNA che sono stati generati da digest di restrizione, con estremità coesive o smussate., Legatura viene solitamente eseguita come reazione separata dopo restrizione digest anche se alcuni protocolli descrivono un metodo di clonazione PCR un tubo in cui restrizione digest e legatura sono autorizzati a verificarsi contemporaneamente nella stessa reazione.
T4 DNA Ligasi: L’unica ligasi di cui avrai mai bisogno?
T4 DNA ligasi è la ligasi più ampiamente utilizzato in biologia molecolare. Come i suoi parenti, le ligasi T3 e T7, prende il nome dal batteriofago da cui è stato identificato per la prima volta. È una ligasi del DNA dipendente ATP perché idrolizza l’ATP durante il legame covalente dei gruppi 5 ‘- PO4 e 3 ‘ – OH.,
Questa ligasi versatile è raccomandata per la maggior parte delle applicazioni di clonazione molecolare di routine in quanto può legare frammenti di DNA a doppio filamento sia smussati che coesivi (di solito tra un vettore plasmidico e un inserto) e T / A clonazione.
Grazie alla versatilità della T4 DNA ligasi nella legatura di estremità coesive e smussate, è stato ottimizzato per una gamma di condizioni per una legatura rapida ed efficiente. Alcune varianti di T4 DNA ligasi sono state progettate per resistere a sale elevato e alte temperature fino a 50°C., Tali DNA ligasi sono utili per reazioni di legatura con alte concentrazioni di sale o temperature elevate. Eseguire la legatura a temperature più elevate riduce il tempo di incubazione e aumenta la specificità della legatura. T4 DNA ligasi è stato utilizzato anche per la legatura rapida, in cui la reazione avviene in 5 minuti a temperatura ambiente invece che durante la notte a 16°C, utilizzando un buffer appositamente ottimizzato che aumenta l’efficienza di legatura. Scegli una ligasi DNA rapida se sei di fretta!
Quindi, la T4 DNA ligasi è l’unica ligasi di cui avrai mai bisogno?, Bene, mentre esegue molte delle applicazioni standard delle ligasi del DNA in laboratorio, presenta alcuni inconvenienti.
Non è particolarmente tollerante al sale
L’attività delle ligasi del DNA T4 inizia a diminuire rapidamente quando le concentrazioni di sale superano i 200 mm, quindi se le condizioni per la legatura comportano alti livelli di sale (ad esempio quando il riporto del sale è un problema dai passaggi precedenti), potresti riscontrare problemi e sarebbe meglio scegliere una ligasi alternativa.
Fortunatamente, sono disponibili altre opzioni., La T3 DNA ligasi, che può anche legare frammenti di DNA smussati e appiccicosi, può tollerare concentrazioni saline fino a 250-300 mM. Tuttavia, questa non è l’unica opzione. Sono state create varianti di T4 ligasi in grado di resistere a concentrazioni saline fino a 500 mm, come la Salt-T4 DNA Ligasi.
Lega le estremità smussate e le estremità coesive
Mentre questo inizialmente potrebbe non sembrare un problema, ci possono essere momenti in cui si ha sia il DNA coesivo che quello smussato in una reazione e si desidera solo legare le estremità coesive., In questa situazione, T7 DNA ligasi è tuo amico in quanto non lega estremità smussate.
E. coli DNA ligasi è un’altra scelta in questo scenario. Questa ligasi non lega le estremità smussate e ha una maggiore affinità per le estremità coesive rispetto alla ligasi T4. E. coli DNA ligasi è un NAD + ligasi dipendente, in modo che il buffer si utilizza sarà diverso da T4 ligasi.
Può legare disallineamenti nei nick
La T4 DNA ligasi è una ligasi molto attiva, e mentre in generale le DNA ligasi preferiscono legare completamente il DNA accoppiato alla base Watson-Crick, la T4 ligasi può legare disallineamenti nei nick del DNA., Se la legatura ad alta fedeltà del DNA scalfito è il vostro obiettivo, allora il NAD+ dipendente Taq DNA ligasi è lo strumento per il lavoro.
La Taq DNA ligasi termostabile è attiva anche a temperature più elevate (37-75oC). La capacità di effettuare la legatura alle temperature elevate e l’più alta fedeltà delle ligasi del DNA di Taq riduce l’incidenza di DNA ricombinante non corrispondente. Ma nota che questo enzima può solo legare i nick e non le estremità smussate o coesive.,
La legatura selettiva dei nick da Taq DNA ligasi lo rende la soluzione perfetta per le tecniche in cui solo i nick devono essere ligati e la legatura finale deve essere soppressa, come alcuni metodi di assemblaggio del DNA. Ci sono numerose applicazioni che utilizzano la legatura ad alta fedeltà di nick da Taq DNA ligasi anche per il rilevamento e la quantificazione di polimorfismi a singolo nucleotide.
Panoramica delle applicazioni Ligasi
Mentre T4 DNA ligasi può essere la ligasi di scelta per molte applicazioni di biologia molecolare, non è sempre la migliore ligasi per il lavoro., Per una rapida panoramica delle caratteristiche delle diverse ligasi, vedere la nostra tabella di ricerca rapida qui sotto.
| Applicazione | T4 | T3 | T7 | E.,ation at high temperatures | ✔** | ✔✔ | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Ligation at high salt conditions | ✔✔*** | ✔✔ | |||||||
| High fidelity ligation of nicks | ✔✔ | ||||||||
| *rapid ligase; **high temperature tolerant varieties; ***high salt tolerant varieties | |||||||||
Keeping the above points in mind, it shouldn’t be difficult to choose a DNA ligase for your next ligation application!, Usi una ligasi diversa da T4? Lascia un commento qui sotto.
Ulteriori letture
DNA Ligasi, T4. Nel Manuale degli enzimi di Worthington. Worthington Biochemical Corporation. (2019).
Shuman, S. DNA Ligasi: progresso e prospettive. CCG. 284(26);17365–9 (2009). DOI 10.1074 / jbc.R900017200
Tabella di selezione Ligasi basata su substrato. Biolab del New England.
Tabella di selezione della DNA ligasi. Biolab del New England.
Lehnman, I. R.. DNA Ligasi: struttura, meccanismo e funzione. Scienza, 186(4166);790-797 (1974). DOI: 10.1126 / scienza.186.4166.,790
Specificità del substrato e discriminazione di mismatch nelle ligasi del DNA. New England Biolabs
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