um gel de agarose com bandas de ADN manchadas com brometo de etídio e visualizadas sob luz UV num Transiluminador UV.
Agarose é uma matriz preferida para o trabalho com proteínas e ácidos nucleicos, uma vez que tem uma ampla gama de estabilidade física, química e térmica, e seu menor grau de complexidade química também faz com que seja menos propenso a interagir com biomoléculas. A Agarose é mais frequentemente utilizada como meio de separação electroforética em escala analítica na electroforese em gel de agarose., Géis feitos de purificada de agarose têm um relativamente grande, o tamanho dos poros, tornando-os úteis para a separação de moléculas grandes, como as proteínas e complexos de proteína >200 kilodaltons, bem como fragmentos de DNA >100 basepairs. A Agarose também é amplamente utilizada em várias outras aplicações, por exemplo imunodifusão e imunoelectroforese, já que as fibras de agarose funcionam como âncora para imunocomplexos.,electroforese em gel de Agarose
a electroforese em gel de Agarose é o método de rotina para a resolução do ADN em laboratório. Os géis de Agarose têm menor poder de resolução para o ADN do que os géis de acrilamida, mas têm maior intervalo de separação, pelo que são normalmente utilizados para fragmentos de ADN com comprimentos de 50-20 000 bp (pares de base), embora a resolução de mais de 6 Mb seja possível com electroforese em gel de campo pulsado (PFGE)., Ele também pode ser usado para separar grandes moléculas proteicas, e é a matriz preferida para a eletroforese gel de partículas com raios efetivos maiores que 5-10 nm.
O tamanho DOS poros do gel afecta o tamanho do ADN que pode ser peneirado. Quanto menor a concentração do gel, maior o tamanho dos poros, e maior o DNA que pode ser crivado. No entanto, géis de baixa concentração (0,1 – 0,2%) são frágeis e, portanto, difíceis de manusear, e a eletroforese de grandes moléculas de DNA pode levar vários dias. O limite de resolução para a eletroforese em gel de agarose padrão é de cerca de 750 kb., Este limite pode ser superado por PFGE, onde campos elétricos ortogonais alternados são aplicados ao gel. Os fragmentos de DNA reorientam-se quando o campo aplicado muda de direção, mas as moléculas maiores de DNA levam mais tempo para realinhar-se quando o campo elétrico é alterado, enquanto para as menores é mais rápido, e o DNA pode, portanto, ser fraccionado de acordo com o tamanho.
géis de Agarose são moldados num molde, e quando configurados, normalmente correm horizontalmente submersos numa solução-tampão., Utilizam-se frequentemente tampões de Tris-acetato-EDTA e Tris-borato-EDTA, mas podem utilizar-se outros tampões, tais como o Tris-fosfato, o ácido barbitúrico-sódico ou os tampões de Tris-barbitúrico noutras aplicações. O DNA é normalmente visualizado através da coloração com brometo de etídio e, em seguida, visto sob uma luz UV, mas outros métodos de coloração estão disponíveis, como SYBR Green, GelRed, azul de metileno, e violeta de cristal. Se os fragmentos de DNA separados são necessários para mais experiências a jusante, eles podem ser cortados do gel em fatias para posterior manipulação.,colunas de filtração em gel à base de Agarose utilizadas para a purificação de proteínas numa máquina AKTA FPLC.
purificationEdit proteico
Agarose gel matrix é frequentemente utilizada para a purificação de proteínas, por exemplo, na separação à escala preparatória à base de coluna, como na cromatografia de filtração em gel, cromatografia de afinidade e cromatografia de permuta iónica. No entanto, não é usado como um gel contínuo, em vez disso é formado em contas porosas ou resinas de finura variável., As contas são altamente porosas para que a proteína possa fluir livremente através das contas. Estas esferas à base de agarose são geralmente macias e facilmente esmagadas, pelo que devem ser utilizadas sob fluxo gravitacional, centrifugação A baixa velocidade ou procedimentos de baixa pressão. A resistência das resinas pode ser melhorada através do aumento da ligação cruzada e do endurecimento químico das resinas de agarose, no entanto, tais alterações podem também resultar numa menor capacidade de ligação às proteínas em alguns procedimentos de separação, tais como a cromatografia de afinidade.,
Agarose é um material útil para a cromatografia porque não absorve biomoléculas de forma significativa, tem boas propriedades de fluxo, e pode tolerar extremos de pH e resistência iónica, bem como alta concentração de desnaturantes, tais como 8m de ureia ou 6m de HCl de guanidina. Exemplos de matriz à base de agarose para a cromatografia de filtração em gel são a Sefarose e as cabeças de trabalho a 40 S (agarose com contas cruzadas), o Praesto e a Superose (agaroses com contas cruzadas) e o Superdex (dextrano ligado covalentemente à agarose).,
para cromatografia de afinidade, a agarose de contas é a resina de matriz mais utilizada para a fixação dos ligantes que se ligam às proteínas. Os ligantes são ligados covalentemente através de um espaçador a grupos hidroxila ativados de polímero de contas de agarose. Proteínas de interesse podem então ser seletivamente ligadas aos ligantes para separá-los de outras proteínas, após o que pode ser eluído. As contas de agarose utilizadas são tipicamente de 4% e 6% de densidades com uma elevada capacidade de ligação para proteínas.,
meio de cultura sólida
placa de Agarose pode, por vezes, ser utilizada em vez de ágar para a cultura de organismos, uma vez que o ágar pode conter impurezas que podem afectar o crescimento do organismo ou alguns procedimentos a jusante, tais como a reacção em cadeia da polimerase (PCR). A Agarose é também mais dura do que o ágar e pode, portanto, ser preferível nos casos em que é necessária uma maior resistência ao gel, e a sua menor temperatura de gelificação pode evitar causar choque térmico ao organismo quando as células estão suspensas no líquido antes da gelificação., Pode ser usado para a cultura de bactérias autotróficas rigorosas, protoplastos vegetais, Caenorhabditis elegans, outros organismos e várias linhas celulares.a Agarose é frequentemente utilizada como suporte para a cultura tridimensional das células humanas e animais. Como a agarose forma um hidrogel não citotóxico, pode ser utilizada para reproduzir o ambiente natural das células no corpo humano, a matriz extracelular. No entanto, a agarose forma um sólido hidrogel inerte que não carrega nenhuma informação biológica, assim as células humanas e animais não podem aderir ao polissacárido., Devido a estas propriedades específicas, o hidrogel de agarose imita o ambiente natural das células de cartilagem e tem sido mostrado para suportar a diferenciação de condrócitos em cartilagem. A fim de modificar as propriedades mecânicas da agarose para reproduzir o ambiente natural de outras células humanas, a agarose pode ser quimicamente modificada através da oxidação precisa do álcool primário da D-galactose em ácido carboxílico. Esta modificação química fornece uma nova classe de materiais chamada agarose carboxilada., Através do controlo do número de D-galactose carboxilada na coluna vertebral polissacárida, as propriedades mecânicas do hidrogel resultante podem ser controladas com precisão. Estes hidrogéis de agarose carboxilados podem então ligar-se covalentemente aos peptídeos para formar hidrogel sobre o qual as células podem aderir. Estes agarose carboxilados têm demonstrado dirigir a organização de células endoteliais humanas em lúmenes polarizados.A mistura de agarose totalmente carboxilada com agarose natural pode ser utilizada para produzir hidrogéis que abrangem toda uma gama de propriedades mecânicas.,
motilidade assaysEdit
Agarose é por vezes usado em vez de agar para medir a motilidade e mobilidade do microrganismo. Espécies móveis serão capazes de migrar, embora lentamente, através do gel poroso e taxas de infiltração podem então ser visualizadas. A porosidade do gel está diretamente relacionada com a concentração de ágar ou agarose no meio, de modo que diferentes géis de concentração podem ser usados para avaliar a mobilidade de uma célula nadando, enxamando, deslizando e twitching. O ensaio de migração celular com sub-agarose pode ser utilizado para medir a quimiotaxia e a quimiocinese., Coloca-se uma camada de gel de agarose entre uma população celular e um quimioatractante. À medida que um gradiente de concentração se desenvolve a partir da difusão do quimioatractante para o gel, várias populações celulares que requerem diferentes níveis de estimulação para migrar podem então ser visualizadas ao longo do tempo usando microfotografia à medida que eles se unem para cima através do gel contra a gravidade ao longo do gradiente.
