enzimele care catalizează ubicuitatea fosfo-IkB sunt active constitutiv. Prin urmare, singurul pas reglementat care dictează soarta IkB și NF-kB este, în majoritatea cazurilor, fosforilarea celor două serine n-terminale din molecula IkB. Deoarece complexul E3IkB poate fi implicat și în degradarea CD4 și β-cateninei, etapa de fosforilare este, de asemenea, cea care oferă specificitate acestei căi de semnalizare., Există doar două excepții de la această cale universală pentru activarea NF-kB. Prima este activarea NF-kB ca răspuns la radiațiile UV, care, deși depinde de degradarea IkB, nu implică fosforilarea IkB N-terminal (Bender et al., 1998; Li și Karin, 1998). A doua excepție este anoxia, care stimulează fosforilarea IkBa la tirozina 42 (Imbert et al., 1996). IkBa fosforilată de tirozină a fost sugerată să se lege de domeniul SH2 al kinazei PI3, care o îndepărtează de NF-kB (Beraud et al., 1999)., Cu toate acestea, acest reziduu de tirozină la poziția 42 a IkBa nu este conservat în alte proteine IkB și, prin urmare, universalitatea acestei căi este discutabilă. Controlul fosforilării IkB ca răspuns la toți ceilalți stimuli de activare NF-kB se bazează pe umerii complexului IkB kinase (IKK).odată ce a devenit clar că evenimentul cheie în activarea NF-kB a fost fosforilarea IkB, următorul pas logic a fost căutarea unei kinaze IkB receptive la stimuli (IKK) care ar putea cataliza acest eveniment., Acest efort a dat roade în urmă cu trei ani, atunci când o proteină kinază, care în mod special phosphorylates N-terminal de reglementare serines de IkBs și a căror activitate a fost stimulat foarte mult de TNFa a fost identificat (DiDonato et al., 1997; Mercurio și colab., 1997). Acest IKK activitate a fost dovedit a fi serină-specific și sensibil la o serie de puternic NF-kB activatori în plus față de TNFa, care stimulează activitatea cu cinetica care se potrivesc cu cele ale IkBa degradare (DiDonato et al., 1997). Măsura în care IKK este activat de un stimul dat pare să dicteze cinetica degradării IkB., Experimentele de filtrare cu Gel au sugerat că IKK este un complex proteic și, într-adevăr, purificarea proteinelor, microsecvența și clonarea moleculară au dus până acum la identificarea a trei polipeptide IKK strâns asociate. Două dintre aceste polipeptide, IKKa (de asemenea, numit IKK1) și IKKß (IKK2) servi drept catalizator subunități de kinazei (DiDonato et al., 1997; Mercurio și colab., 1997; Zandi și colab., 1997, 1998), în timp ce a treia polipeptidă, IKKy (cunoscută și sub numele de NEMO sau IKKAP1), servește ca subunitate de reglementare (Mercurio et al., 1999; Rothwarf și colab., 1998; Yamaoka și colab., 1998).,IKKa a fost, de asemenea, izolat printr-un ecran cu două hibrizi ca o proteină care interacționează cu kinaza kinazei kinazei (MAP3K), NIK (kinaza inductoare NF-kB) (Régnier et al., 1997). Deși în experimentele de supraexpresie în celulele de cultură tisulară, NIK acționează ca un activator puternic atât al IKK, cât și al NF-kB (Karin și Delhase, 1998; Malinin et al., 1997; Régnier et al., 1997; Woronicz și colab., 1997), experimentele recente pun la îndoială implicarea sa în activarea IKK fie de TNFa, fie de IL-1 (Baud et al., 1999)., În sprijinul acestor rezultate bazate pe experimente tranzitorii de transfecție, sa constatat recent că mutația aly a mouse-ului, care are ca rezultat pierderea organelor limfoide, este o mutație punctuală în gena care codifică NIK (Shinkura et al., 1999). Analiza celulelor derivate de la șoarecii aly indică faptul că activarea mediată de IL-1 și TNFa A NF-kB este normală. Deoarece aspectul fenotipic al șoarecilor aly este similar cu cel al șoarecilor cu deficit de limfotoxină (LT) (Shinkura et al., 1999), este probabil ca NIK să funcționeze ca mediator al semnalizării LT și să nu aibă niciun rol în semnalizarea TNFa sau IL-1., Deși o interacțiune între NIK și IKKa a fost detectată în celulele de drojdie sau la supraexprimarea celor două kinaze în celulele de mamifere, până în prezent nu a fost detectată în condiții fiziologice. În plus, subunitatea IKKa, care a fost propusă a fi ținta preferențială pentru NIK (Ling et al., 1998), nu este implicat direct în activarea IKK (Delhase et al., 1999; Hu și colab., 1999).,
IKKa și IKKß au foarte similar structuri primare (52% din total identitate) și conțin proteine kinaza domenii la N termini, și leucina fermoare (LZ) și helix – loop – helix (HLH) motivele lor C-terminal porțiuni (Figura 2). IKKy nu conține un domeniu catalitic recunoscut, dar este compus în cea mai mare parte din trei mari regiuni α-elicoidale, inclusiv un LZ (Figura 2). Analiza biochimică a două linii de celule indică faptul că principala formă de IKK este un IKKa:IKKß heterodimer asociat cu nici un dimer sau trimer de IKKy (Rothwarf et al., 1998)., O a patra proteină, o proteină asociată complexului IKK numită IKAP, a fost propusă a fi implicată în activarea IKK (Cohen et al., 1998). Cu toate acestea, deoarece IKAP nu este un constituent ușor detectat al complexului IKK, semnificația și funcția sa fiziologică nu sunt încă clare. În plus, secvența de analiză sugerează că IKAP este uman homolog de una dintre componentele de drojdie transcripțional alungire `Elongator’ complex (Otero et al., 1999). Astfel, IKAP este cel mai probabil o proteină nucleară și, prin urmare, este puțin probabil să servească drept componentă a complexului IKK citoplasmatic.,
Cele trei componente ale IkB-kinazei (IKK). Sunt indicate principalele motive structurale și funcționale ale IKKa, IKKß și IKKy., Kinaza D, kinazei domeniu; LZ, leucina fermoar; HLH, helix – buclă – helix; α, α elicoidale regiune capabile să formeze spiralat-bobine
după Cum sa menționat mai sus, nativ IKK complexe purificat din celule de mamifere de până acum par să fi asamblate doar de IKKa:IKKß heterodimeri plus un număr nedeterminat de IKKy subunități (Rothwarf et al., 1998). In vitro, IKKa și IKKß pot forma atât homo-cât și heterodimeri într-o manieră care depinde de integritatea motivelor lor LZ (Zandi et al., 1998)., Prin urmare, este posibil ca IKKa:IKKß heterodimeri forma mai întâi și apoi de a interacționa cu IKKy, care mediază formarea unui dimer de dimeri. Într-adevăr, în IKKy-deficit de celule, IKKa și IKKß sunt prezente într-o 300 kDa complexe, spre deosebire de mare, de 700 – 900 kDa complexe prezente în sălbăticie-tip celule (Yamaoka et al., 1998). Complexul mic de 300 kDa este, de asemenea, detectat atunci când IKKa sau IKKß sunt supraexprimate (Zandi et al., 1997) și reticulare indică faptul că acest complex este un dimer de IKKa și IKKß (Zandi și colab., 1998).,când sunt examinate ca proteine marcate cu epitopi exprimate tranzitoriu în celulele mamiferelor, IKKa și IKKß prezintă cinetică de activare identică și specificități ale substratului (Mercurio et al., 1997; Zandi și colab., 1997). Cu toate acestea, este important să realizăm că, deși foarte reproductibile, astfel de experimente sunt oarecum înșelătoare, deoarece tranzitor și-a exprimat proteine ușor schimb cu omologii lor endogene și sunt încorporate în mare IKK complexe (Zandi et al., 1997)., Astfel, atunci când se precipită Ikka cu epitop și se măsoară activitatea kinazei IkB asociate, nu este clar dacă se măsoară activitatea proteinei IKKa exogene sau activitățile IKKa endogene sau IKKß cu care se asociază. Chiar și mutanții catalizatori inactivi ai IKKa și IKKß s-au dovedit a se asocia cu o cantitate substanțială de activitate kinazei IkB inductibilă de citokină la expresia tranzitorie (Zandi et al., 1997)., Cu toate acestea, supraexpresia vastă a IKKa sau IKKß inactive catalitic poate inhiba activarea NF-kB ca răspuns la TNFa, măsurată prin inhibarea translocării nucleare a RelA (Zandi et al., 1997).activitățile kinazei IKKa și IKKß și abilitățile lor de a fi activate depind de dimerizarea lor mediată de LZ, iar mutațiile LZ care interferează cu acest proces elimină activitatea kinazei IkB (Zandi et al., 1997, 1998). Activitatea IKKa sau IKKß este, de asemenea, abolită de mutații în motivul HLH (Zandi et al., 1997, 1998)., Mutațiile HLH, cu toate acestea, nu interferează cu dimerizarea sau legarea la IKKy. Mai degrabă, motivul HLH pare să interacționeze cu domeniul kinazei și poate stimula activitatea sa atunci când este exprimată în trans (Delhase et al., 1999).activarea IKK depinde și de prezența unei subunități IKKy intacte. Nici activitatea IKK, nici NF-kB nu pot fi determinate în celulele cu deficit de IKKy după tratamentul cu TNFa, IL-1, endotoxină sau dsRNA (Yamaoka et al., 1998)., În plus, complexele IKK asamblate pe un mutant de trunchiere a IKKy care nu are LZ Terminal C sunt refractare la toți acești agoniști (Rothwarf et al., 1998). Aceste rezultate oferă o dovadă genetică a importanței IKK în activarea NF-kB și sugerează că regiunea C-terminal a IKKy este necesară pentru recrutarea activatorilor din amonte (probabil IKK-kinases sau IKK-Ks). În plus, supraexpresia IKKy poate inhiba activarea IKK datorită titrării activatorilor IKK limitatori care rămân de identificat (Li et al., 1999b).,activarea IKK depinde de fosforilarea subunității sale IKKß (Delhase et al., 1999). Prima dovadă a unui rol pentru fosforilare în activarea IKK a fost obținută prin tratarea complexului IKK activat purificat cu proteina fosfatază 2A (PP2A), care a dus la inactivarea IKK (DiDonato et al., 1997). În plus, tratamentul celulelor cu acid okadaic, un inhibitor PP2A, are ca rezultat activarea lentă a IKK (și, în consecință, NF-kB). Mai recent, sa demonstrat că incubarea celulelor cu TNFa stimulează fosforilarea tuturor celor trei subunități IKK (Delhase et al., 1999)., IKKa și IKKß sunt fosforilate exclusiv la serine, în timp ce IKKy este fosforilat pe serină și treonină. Localizarea acestor serine a fost cartografiată biochimic numai pentru IKKß, dar se poate presupune că siturile echivalente sunt, de asemenea, fosforilate pe IKKa. Două dintre Serinele IKKß fosfo-acceptor sunt situate în bucla sa de activare (Delhase et al., 1999), o porțiune a domeniului kinazei care este similară cu o regiune implicată în activarea dependentă de fosforilare a altor protein kinaze (Zheng și Guan, 1994)., Cel mai frecvent, forma non-fosforilată a buclei de activare se pliază înapoi pe domeniul kinazei și interferează cu intrarea substraturilor ATP și peptidice în buzunarul catalitic. Fosforilarea îndepărtează bucla de activare de buzunarul catalitic, permițând astfel intrarea și legarea substraturilor (Johnson et al., 1996). Înlocuirea a două fosfo-acceptarea serines (S177 și S181) în T buclă de IKKß cu alaninele previne activarea acestuia, în timp ce înlocuirea lor cu fosfo-mimetice glutamat reziduuri provoacă activarea constitutivă (Delhase et al., 1999; Mercurio și colab., 1997)., Interesant, cu toate acestea, înlocuirea echivalent serines (S176 și S180) în IKKa desființează IKKa autophosphorylation dar nu are efect în stimularea total IKK activitate asociate cu IKKa(A176/A180) mutant de TNFa, IL-1 sau amonte kinaze MEKK1 și NIK (Delhase et al., 1999). Aceste rezultate au fost primele care au evidențiat diferențele funcționale dintre cele două subunități catalitice, iar aceste rezultate au fost confirmate ulterior prin analize genetice., Pe baza acestor rezultate, IKK este activată ca răspuns la proinflamatorii stimuli prin fosforilarea IKKß; deși IKKa fosforilare este concomitentă cu cea a IKKß, nu este esențial pentru stimularea IkB activitatea kinazei. Cu alte cuvinte, subunitatea IKKß și nu IKKa servește drept țintă pentru activatorii din amonte implicați în semnalizarea proinflamatorie. Acești activatori sunt recrutați în complex prin intermediul subunității IKKy, cel mai probabil prin interacțiunea cu domeniul său C-terminal.fosforilarea poate duce, de asemenea, la reglarea negativă a activității IKK., În plus față de activarea acestuia buclă, IKKß este pe larg fosforilată într-o regiune situată între HLH motiv și C terminus, care conține mai multe serines (Delhase et al., 1999). Fosforilarea acestor serine depinde de activitatea autokinazei și se presupune că apare ulterior fosforilării buclei de activare. Experimentele de mutageneză indică faptul că siturile de autofosforilare C-terminale sunt implicate în reglarea în jos a activității kinazei (Delhase et al., 1999)., Înlocuire de nouă sau zece ani de C-terminal serines de IKKß cu alaninele rezultatele într-un mutant care rămâne activă de patru ori mai mult decât de tip sălbatic enzimei, în timp ce substituirea aceleași site-uri cu phosphomimetic acid glutamic reziduuri rezultate într-un mutant enzima care cu greu poate fi activat. Pe baza acestor rezultate, a fost propus un model în trei etape pentru a explica reglementarea activității IKK (Figura 3; Delhase et al., 1999). Inițial, complexul IKK inactiv nu este fosforilat. Ca răspuns la stimulii din amonte, IKK-K-urile sunt activate și recrutate în complexul IKK prin intermediul subunității IKKy., Aceasta are ca rezultat fosforilarea buclei de activare IKKß și activarea IKK. Este probabil ca doar o mică parte din IKK să fie activată inițial prin fosforilare directă de către IKK-Ks. Cu toate acestea, prin trans-autophosphorylation activat IKKß subunitate poate fosforila un adiacente subunitate, care pot fi fie IKKa sau IKKß, precum și alte inactiv IKK complexe printr-un intermoleculare reacție., În sprijinul acestei ipoteze, simpla supraexprimarea de IKKß în Sf9 insecte celule este suficient pentru activarea acestuia, iar această activare este absolut dependentă de autophosphorylation. Complexele IKK activate apoi subunitățile IkB fosforilate în complexele NF-kB:IkB, declanșând degradarea lor dependentă de ubiquitină și activarea NF-kB. Concomitent și poate datorită scăderii abundenței IkB, subunitățile IKKß activate (și, probabil, și subunitățile IKKa) suferă autofosforilare C-terminal., Această reacție, care este puțin probabil să fie processive, dar ar putea fi reglementată de nivelul de IkB, funcționează ca un dispozitiv de sincronizare, astfel încât atunci când cel puțin nouă de C-terminal serines sunt fosforilate enzima ajunge la o activitate scăzută de stat. Odată ajuns în această stare, IKK devine sensibil la inactivarea prin fosfataze, mai ales odată ce semnalul din amonte a dispărut., Deoarece siturile de autofosforilare C-terminale sunt adiacente motivului HLH, ele își pot exercita efectul negativ asupra activității kinazei prin schimbarea conformației acestui domeniu activator intrinsec al kinazei și afectând interacțiunea acestuia cu domeniul catalitic. Acest mod de reglementare explică de ce IKK este de obicei activat într-un mod foarte tranzitoriu.
O în trei etape model de regulament de IKK activitatea de fosforilare., Cele două subunități catalitice ale IKK (IKKa și IKKß) se asociază într-un heterodimer prin fermoarele lor de leucină (LZ). În celulele ne-stimulate, bucla de activare din domeniul kinazei (KD) nu este fosforilată, iar motivul helix – loop – helix (HLH) contactează domeniul kinazei. Clusterul de fosforilare C-terminal nu este nici fosforilat. La celula de stimulare cu TNFa sau IL-1, activarea buclei de IKKß este fosforilată și prin trans-autophosphorylation de a doua subunitate (fie IKKa sau IKKß, în caz de un homodimer) IKK este activat., Odată activat, în plus față de fosforilarea IkBs, IKK suferă o autofosforilare progresivă la clusterul său de serină C-terminal. Când cel puțin nouă dintre serinele C-terminale sunt fosforilate, repulsia electrostatică modifică interacțiunea dintre motivul HLH activator și domeniul kinazei, astfel încât kinaza atinge o stare de activitate scăzută., În această stare IKK este probabil să fie mai predispuse la inhibarea de către fosfataza acțiune
Datorită capacității de IKKß pentru a propaga sale active de stat prin intermediul autophosphorylation este important să avem un mecanism pentru reducerea acesteia activitatea kinazei și face sensibile la inactivarea prin fosfatazei. Fără autoreglarea negativă, un singur bolus al unei citokine proinflamatorii ar putea duce la activarea prelungită a IKK, ceea ce duce la activarea prelungită a NF-kB, urmată de creșterea producției de mediatori inflamatori primari și secundari., Ca acești mediatori pot provoca în continuare NF-kB de activare (Barnes și Karin, 1997), există un risc real că, în lipsa de eficiente mecanisme de feedback negativ chiar și un minor proinflamatorii insulta ar duce la o catastrofă majoră, cum ar fi șocul septic.interesant este însă că activarea IKK constitutivă poate apărea în stări patogene și a fost recent documentată în celulele bolii Hodgkin (Krappmann et al., 1999; revizuit în Rayet și Gélinas, 1999, această problemă) și în celulele T infectate cu HTLV-1 (Uhlik et al., 1998; revizuit în Sun și Ballard, 1999, acest număr)., Deși bazele moleculare pentru aceste modificări ale comportamentului IKK sunt necunoscute, activarea constitutivă NF-kB care rezultă protejează aceste celule de inducerea apoptozei prin radio – și chemoterapie (Bargou et al., 1997). De fapt, activitatea crescută a NF-kB și IKK poate proteja numeroase tipuri de tumori de terapiile care induc apoptoza (Gilmore, 1997). Astfel, IKK este o țintă atractivă pentru dezvoltarea de noi medicamente anti-tumorale. Cu toate acestea, după cum se va discuta mai jos, inhibarea completă a activității IKK poate determina reacții adverse nedorite.
