LIGAZELE ADN, inclusiv ligaza ADN-ului molecular biology power tool T4, sunt enzime care facilitează îmbinarea firelor ADN prin catalizarea formării legăturii fosfodiesterice între grupurile 5′-PO4 și 3′ – OH ale coloanei vertebrale a ADN-ului. În organisme, ligaza ADN joacă un rol important în repararea pauzelor din ADN introduse în timpul replicării și deteriorării, asigurând astfel integritatea informațiilor genetice.,având în vedere rolurile lor vitale în repararea și replicarea ADN-ului, activitatea ligazei ADN în celule a fost propusă să existe chiar înainte de descoperirea lor. Două observații au stimulat căutarea LIGAZELOR ADN.
- apariția recombinării genetice prin ruperea și re-unirea moleculelor de ADN.
- formarea cercurilor închise prin ADN liniar din bacteriofagul I după infecție.în 1967, LIGAZELE ADN au fost descoperite independent de laboratoarele Gellert, Lehman, Richardson și Hurwitz., De la descoperirea lor, LIGAZELE ADN au devenit instrumente importante în biologia moleculară. LIGAZELE ADN sunt utilizate în clonarea moleculară pentru a uni fragmentele ADN împreună pentru a crea ADN recombinant, cum ar fi atunci când o bucată de ADN străin este inserată într-o plasmidă.cele mai multe reacții de ligare implică fragmente de ADN care au fost generate de digerarea restricțiilor, fie cu capete coezive, fie cu capete contondente., Ligatura se face de obicei separat ca o reacție după restricție digera deși unele protocoale descrie un singur tub PCR clonarea metodă în cazul în care restricția de digerat și ligatura sunt permise pentru a avea loc concomitent în aceeași reacție.
T4 ADN Ligase: singura Ligase veți avea nevoie vreodată?
ligaza ADN T4 este cea mai utilizată ligază în biologia moleculară. Ca și rudele sale, ligazele T3 și T7, este numit după bacteriofagul din care a fost identificat pentru prima dată. Este o ligază ADN dependentă de ATP, deoarece hidrolizează ATP în timpul legăturii covalente a grupelor 5′-PO4 și 3 ‘ – OH.,această ligază versatilă este recomandată pentru majoritatea aplicațiilor de clonare moleculară de rutină, deoarece poate lega atât fragmente de ADN dublu catenar bont, cât și coeziv (de obicei între un vector plasmidic și o inserție), precum și clonarea T/A.datorită versatilității ligazei ADN T4 în ligarea capetelor coezive și contondente, aceasta a fost optimizată pentru o serie de condiții pentru o ligare rapidă și eficientă. Unele variante de ligază ADN T4 au fost proiectate pentru a rezista la sare ridicată și temperaturi ridicate de până la 50°C., Astfel de ligaze ADN sunt utile pentru reacțiile de ligare cu concentrații ridicate de sare sau temperaturi ridicate. Efectuarea ligării la temperaturi mai ridicate reduce timpul de incubație și crește specificitatea ligării. Ligaza ADN T4 a fost de asemenea utilizată pentru ligarea rapidă, în care reacția are loc în 5 minute la temperatura camerei în loc de peste noapte la 16°C, folosind un tampon special optimizat care crește eficiența ligării. Alegeți o ligază ADN rapidă dacă vă grăbiți!deci, este ligaza ADN T4 singura ligază de care veți avea nevoie vreodată?, Ei bine, în timp ce efectuează multe dintre aplicațiile standard ale LIGAZELOR ADN în laborator, are unele dezavantaje.activitatea LIGAZELOR ADN T4 începe să scadă rapid atunci când concentrațiile de sare depășesc 200 mM, deci dacă condițiile pentru ligarea dvs. implică niveluri ridicate de sare (de exemplu, atunci când transferul de sare este o problemă din etapele anterioare), este posibil să aveți probleme și ar fi mai bine să alegeți o ligază alternativă.din fericire, alte opțiuni sunt disponibile., T3 ADN ligase, care poate lega, de asemenea, atât fragmente de ADN contondente și lipicioase, poate tolera concentrații de sare de până la 250-300 mM. cu toate acestea, aceasta nu este singura dvs. opțiune. Au fost create variante de ligază T4 care pot rezista la concentrații de sare de până la 500 mM, cum ar fi ligaza ADN sare-T4.în timp ce acest lucru inițial nu poate părea o problemă, pot exista momente în care aveți atât ADN-ul coeziv, cât și ADN-ul într-o reacție și doriți doar să legați capetele coezive., În această situație, ligaza ADN T7 este prietenul tău, deoarece nu leagă capetele contondente.ligaza ADN E. coli este o altă alegere în acest scenariu. Această ligază nu leagă capetele contondente și are o afinitate mai mare pentru capetele coezive decât ligaza T4. Ligaza ADN E. coli este o ligază dependentă de NAD+, astfel încât tamponul pe care îl utilizați va fi diferit de ligaza T4.
se poate lega nepotriviri în Nicks
T4 ADN ligase este o ligază foarte activă, și în timp ce, în general, LIGAZELE ADN preferă să ligate complet Watson-Crick ADN-ul pereche de bază, T4 ligase poate ligate nepotriviri în nicks ADN., Dacă ligarea de înaltă fidelitate a ADN-ului crestat este obiectivul dvs., atunci ligaza ADN Taq dependentă de NAD+ este instrumentul pentru lucrare.
ligaza ADN Taq termostabilă este, de asemenea, activă la temperaturi mai ridicate (37-75oc). Capacitatea de a efectua ligarea la temperaturi ridicate și fidelitatea mai mare a LIGAZELOR ADN Taq reduce incidența ADN-ului recombinant necorespunzător. Dar rețineți că această enzimă poate lega doar nituri și nu capete contondente sau coezive.,
ligarea selectivă a nicks prin ligaza ADN Taq o face soluția perfectă pentru tehnicile în care doar nicks trebuie să fie ligate și ligarea finală trebuie suprimată, cum ar fi unele metode de asamblare a ADN-ului. Există numeroase aplicații care utilizează ligarea de înaltă fidelitate a nicks prin ligaza ADN Taq, inclusiv pentru detectarea și cuantificarea polimorfismelor nucleotidice unice.în timp ce ligaza ADN T4 poate fi ligaza de alegere pentru multe aplicații de biologie moleculară, nu este întotdeauna cea mai bună ligază pentru slujbă., Pentru o imagine de ansamblu rapidă a caracteristicilor diferitelor ligaze, consultați tabelul nostru de căutare rapidă de mai jos.
Aplicare T4 T3 T7 E.,ation at high temperatures ✔** ✔✔ Ligation at high salt conditions ✔✔*** ✔✔ High fidelity ligation of nicks ✔✔ *rapid ligase; **high temperature tolerant varieties; ***high salt tolerant varieties Keeping the above points in mind, it shouldn’t be difficult to choose a DNA ligase for your next ligation application!, Utilizați o altă ligază decât T4? Lasă un comentariu mai jos.
Lectură suplimentară
ADN Ligase, T4. În Manualul Enzimei Worthington. Worthington Biochemical Corporation. (2019).Shuman, S. LIGASES ADN: progres și perspective. JBC. 284(26);17365–9 (2009). DOI 10.1074 / jbc.R900017200
diagrama de selecție a ligazei pe bază de substrat. Biolab-Uri Din New England.
diagrama de selecție a ligazei ADN. Biolab-Uri Din New England.
Lehnman, I. R.. Ligaza ADN: structura, mecanismul și funcția. Știință, 186(4166);790-797 (1974). DOI: 10.1126 / știință.186.4166.,790
specificitatea substratului și discriminarea nepotrivită în ligazele ADN. New England Biolabs
v-a ajutat acest lucru? Apoi, vă rugăm să partajați cu rețeaua.
scris de Daphne ng
