Un gel de agaroză cu benzi de ADN colorate cu bromură de etidiu și vizualizate în lumină UV pe un Transiluminator UV.agaroza este o matrice preferată pentru lucrul cu proteine și acizi nucleici, deoarece are o gamă largă de stabilitate fizică, chimică și termică, iar gradul său mai scăzut de complexitate chimică face, de asemenea, mai puțin probabil să interacționeze cu biomoleculele. Agaroza este cel mai frecvent utilizat ca mediu pentru separarea electroforetică la scară analitică în electroforeză în gel de agaroză., Geluri realizate din purificat de agaroză au o relativ mare dimensiune a porilor, ceea ce le face utile pentru separarea unor molecule mari, cum ar fi proteine și proteine complexe >200 de kilodaltoni, precum și fragmente de ADN >100 basepairs. Agaroza este, de asemenea, utilizată pe scară largă pentru o serie de alte aplicații, de exemplu imunodifuzia și imunoelectroforeza, deoarece fibrele de agaroză funcționează ca o ancoră pentru imunocomplexe.,
Electroforeza gelului de Agarozăedit
electroforeza gelului de agaroză este metoda de rutină pentru rezolvarea ADN-ului în laborator. Gelurile de agaroză au o putere de rezolvare mai mică pentru ADN decât gelurile acrilamidă, dar au o gamă mai mare de separare și, prin urmare,sunt utilizate de obicei pentru fragmente de ADN cu lungimi de 50-20.000 bp (perechi de baze), deși rezoluția de peste 6 Mb este posibilă cu electroforeza în gel în câmp pulsat (PFGE)., Poate fi folosit și pentru separarea moleculelor mari de proteine și este matricea preferată pentru electroforeza în gel a particulelor cu raze eficiente mai mari de 5-10 nm.dimensiunea porilor gelului afectează dimensiunea ADN-ului care poate fi cernut. Cu cât concentrația gelului este mai mică, cu atât dimensiunea porilor este mai mare și cu atât este mai mare ADN-ul care poate fi cernut. Cu toate acestea, gelurile cu concentrație scăzută (0,1 – 0,2%) sunt fragile și, prin urmare, greu de manevrat, iar electroforeza moleculelor mari de ADN poate dura câteva zile. Limita de rezoluție pentru electroforeza standard în gel de agaroză este de aproximativ 750 kb., Această limită poate fi depășită de PFGE, unde câmpurile electrice ortogonale alternante sunt aplicate gelului. Fragmentele de ADN se reorientează atunci când câmpul aplicat comută direcția, dar moleculele mai mari de ADN durează mai mult pentru a se realinia atunci când câmpul electric este modificat, în timp ce pentru cele mai mici este mai rapid, iar ADN-ul poate fi fracționat în funcție de dimensiune.gelurile de agaroză sunt turnate într-o matriță și, atunci când sunt setate, se execută de obicei orizontal scufundat într-o soluție tampon., Tampoanele Tris-acetat-EDTA și Tris-Borat-EDTA sunt utilizate în mod obișnuit, dar alte tampoane, cum ar fi Tris-fosfat, acid barbituric-barbiturat de sodiu sau tampoane Tris-barbiturice pot fi utilizate în alte aplicații. ADN – ul este vizualizat în mod normal prin colorare cu bromură de etidiu și apoi vizualizat sub o lumină UV, dar sunt disponibile și alte metode de colorare, cum ar fi verde SYBR, GelRed, albastru de metilen și violet de cristal. În cazul în care fragmentele ADN separate sunt necesare pentru experiment suplimentar în aval, ele pot fi tăiate din gel în felii pentru manipulare ulterioară.,
coloane de filtrare cu gel pe bază de agaroză utilizate pentru purificarea proteinelor pe o mașină AKTA FPLC.
Proteine purificationEdit
gel de Agaroză matrice este adesea folosit pentru purificare a proteinelor, de exemplu, în coloana bazate pe scară preparativă de separare ca și în gel filtrare, cromatografie cromatografie de afinitate și cromatografie cu schimb de ioni. Cu toate acestea, nu este utilizat ca gel continuu, ci este format în margele poroase sau rășini de finețe variabilă., Margelele sunt foarte poroase, astfel încât proteina poate curge liber prin margele. Aceste margele pe bază de agaroză sunt, în general, moi și ușor zdrobite, astfel încât acestea ar trebui să fie utilizate sub flux gravitațional, centrifugare cu viteză mică sau proceduri de joasă presiune. Rezistența rășinilor poate fi îmbunătățită prin reticularea crescută și întărirea chimică a rășinilor de agaroză, cu toate acestea, astfel de modificări pot duce, de asemenea, la o capacitate de legare mai mică pentru proteine în unele proceduri de separare, cum ar fi cromatografia de afinitate.,agaroza este un material util pentru cromatografie, deoarece nu absoarbe biomolecule într-o măsură semnificativă, are proprietăți bune de curgere și poate tolera extreme de pH și rezistență Ionică, precum și concentrație ridicată de denaturanți, cum ar fi 8m uree sau 6m guanidină HCl. Exemple de agaroză pe baza matricei de gel filtrare, cromatografie sunt Sepharose și WorkBeads 40 SEC (cross-linked cu margele de agaroză), Praesto și Superose (foarte reticulat cu margele agaroses), și Superdex (dextran covalent legate de agaroză).,pentru cromatografia de afinitate, agaroza cu margele este cea mai frecvent utilizată rășină matricială pentru atașarea liganzilor care leagă proteina. Liganzii sunt legați covalent printr-un distanțier la grupările hidroxil activate de polimer de mărgele de agaroză. Proteinele de interes pot fi apoi legate selectiv de liganzi pentru a le separa de alte proteine, după care pot fi eluate. Perlele de agaroză utilizate sunt de obicei densități de 4% și 6%, cu o capacitate mare de legare pentru proteine.,placa de agaroză poate fi uneori utilizată în loc de agar pentru cultivarea organismelor, deoarece agar poate conține impurități care pot afecta creșterea organismului sau unele proceduri în aval, cum ar fi reacția în lanț a polimerazei (PCR). Agaroza este, de asemenea, mai dură decât agar și, prin urmare, poate fi preferabilă în cazul în care este necesară o rezistență mai mare a gelului, iar temperatura sa scăzută de gelificare poate preveni producerea șocului termic organismului atunci când celulele sunt suspendate în lichid înainte de gelificare., Acesta poate fi utilizat pentru cultura de bacterii autotrofice stricte, protoplast de plante, Caenorhabditis elegans, alte organisme și diferite linii celulare.
cultura celulelor 3DEDIT
agaroza este adesea folosită ca suport pentru cultura tridimensională a celulelor umane și animale. Deoarece agaroza formează un hidrogel non-citotoxic, acesta poate fi utilizat pentru a reproduce mediul natural al celulelor din corpul uman, matricea extracelulară. Cu toate acestea, agaroza formează un hidrogel rigid inert care nu poartă nicio informație biologică, astfel încât celulele umane și animale nu pot adera la polizaharidă., Datorită acestor proprietăți specifice, hidrogelul de agaroză imită mediul natural al celulelor cartilajului și s-a dovedit că susține diferențierea condrocitelor în cartilaj. Pentru a modifica proprietățile mecanice ale agarozei pentru a reproduce mediul natural al altor celule umane, agaroza poate fi modificată chimic prin oxidarea precisă a alcoolului primar al D-galactozei în acid carboxilic. Această modificare chimică oferă o nouă clasă de materiale numite agaroză carboxilată., Prin controlul numărului de D-galactoză carboxilată pe coloana vertebrală polizaharidică, proprietățile mecanice ale hidrogelului rezultat pot fi controlate cu precizie. Aceste hidrogeluri de agaroză carboxilată pot fi apoi legate covalent de peptide pentru a forma hidrogel pe care celulele pot adera. S-a demonstrat că aceste hidrogeluri de agaroză carboxilate direcționează organizarea celulelor endoteliale umane în lumeni polarizați.Amestecarea agarozei complet carboxilate cu agaroza naturală poate fi utilizată pentru a face hidrogeluri care acoperă o gamă largă de proprietăți mecanice.,
teste de Motilitateedit
agaroza este uneori utilizată în loc de agar pentru a măsura motilitatea și mobilitatea microorganismelor. Speciile Motile vor putea migra, deși încet, pe tot parcursul gelului poros și ratele de infiltrare pot fi apoi vizualizate. Porozitatea gelului este direct legată de concentrația de agar sau agaroză în mediu, astfel încât geluri de concentrație diferite pot fi utilizate pentru a evalua motilitatea de înot, roire, alunecare și răsucire a unei celule. Testul de migrare a celulelor sub agaroză poate fi utilizat pentru a măsura chemotaxia și chemokineza., Un strat de gel de agaroză este plasat între o populație de celule și un chemoatractant. Ca un gradient de concentrație se dezvoltă de la difuzie de chemoatractant în gel, diferite populații celulare care necesită diferite niveluri de stimulare a migra pot fi apoi vizualizate pe timp folosind microfotografie ca ei tunel în sus prin gel impotriva gravitatiei de-a lungul gradientului.
