Las enzimas que catalizan la ubiquitinación de phospho-IkB son constitutivamente activas. Por lo tanto, el único paso regulado que dicta el destino de IkB y NF-kB es en la mayoría de los casos la fosforilación de las dos serinas N-terminales en la molécula IkB. Como el complejo E3IkB también puede estar involucrado en la degradación de CD4 y β-catenina, el paso de fosforilación es también el que proporciona especificidad a esta vía de señalización., Solo hay dos excepciones a esta vía universal para la activación de NF-kB. La primera es la activación de NF-kB en respuesta a la radiación UV, que aunque depende de la degradación IkB no implica fosforilación IkB N-terminal (Bender et al., 1998; Li y Karin, 1998). La segunda excepción es la anoxia, que estimula la fosforilación de IkBa en la tirosina 42 (Imbert et al., 1996). Se ha sugerido que la tirosina fosforilada IkBa se une al dominio SH2 de la PI3 quinasa, que la aleja de NF-kB (Beraud et al., 1999)., Este residuo de tirosina en la posición 42 de IkBa, sin embargo, no se conserva en otras proteínas IkB y por lo tanto la universalidad de esta vía es cuestionable. El control de la fosforilación IkB en respuesta a todos los demás estímulos Activadores de NF-kB descansa en los hombros del complejo IkB quinasa (IKK).
Una vez que quedó claro que el evento clave en la activación de NF-kB era la fosforilación IkB, el siguiente paso lógico fue buscar una cinasa IkB sensible al estímulo (IKK) que pudiera catalizar este evento., Este esfuerzo dio sus frutos hace tres años cuando se identificó una proteína quinasa que fosforila específicamente las serinas reguladoras N-terminales de IkBs y cuya actividad fue muy estimulada por el TNFa (DiDonato et al., 1997; Mercurio et al., 1997). Se demostró que esta actividad IKK es específica de la serina y responde a una serie de potentes Activadores de NF-kB además del TNFa, que estimulan su actividad con cinéticas que coinciden con las de la degradación de IkBa (DiDonato et al., 1997). El grado en que IKK es activado por un estímulo dado parece dictar la cinética de la degradación de IkB., Los experimentos de filtración de Gel sugirieron que IKK es un complejo de proteínas y, de hecho, la purificación de proteínas, la microsecuenciación y la clonación molecular han resultado hasta ahora en la identificación de tres polipéptidos IKK estrechamente asociados. Dos de estos polipéptidos, IKKa (también llamado IKK1) e IKKß (IKK2) sirven como las subunidades catalíticas de la quinasa (DiDonato et al., 1997; Mercurio et al., 1997; Zandi et al., 1997, 1998), mientras que el tercer polipéptido, IKKy (también conocido como Nemo o IKKAP1), sirve como su subunidad reguladora (Mercurio et al., 1999; Rothwarf et al., 1998; Yamaoka et al., 1998).,
IKKa también se aisló a través de una pantalla de dos híbridos como una proteína que interactúa con la quinasa quinasa quinasa MAP (MAP3K), Nik (cinasa inductora de NF-kB) (Régnier et al., 1997). Aunque en experimentos de sobreexpresión en células de cultivo de tejidos, NIK actúa como un potente activador tanto de IKK como de NF-kB (Karin y Delhase, 1998; Malinin et al., 1997; Régnier et al., 1997; Woronicz et al., 1997), experimentos recientes cuestionan su participación en la activación de IKK por TNFa o IL-1 (Baud et al., 1999)., En apoyo de estos resultados basados en experimentos de transfección transitoria, se encontró recientemente que la mutación Aly del ratón, que resulta en la pérdida de órganos linfoides, es una mutación puntual en el gen que codifica NIK (Shinkura et al., 1999). El análisis de células derivadas de ratones aly indica que la IL-1 y la activación mediada por TNFa de NF-kB son normales. Como la apariencia fenotípica de los ratones aly es similar a la de los ratones con deficiencia de linfotoxina (LT) (Shinkura et al., 1999), es probable que NIK funcione como mediador de la señalización del LT y no tenga papel en la señalización de TNFa o IL-1., Aunque se detectó una interacción entre Nik E IKKa en células de levadura o sobreexpresión de las dos quinasas en células de mamíferos, hasta ahora no se ha detectado en condiciones fisiológicas. Además, la subunidad IKKa, que se propuso como objetivo preferencial para NIK(Ling et al., 1998), no está directamente involucrado en la activación de IKK (Delhase et al., 1999; Hu et al., 1999).,
IKKa e IKKß tienen estructuras primarias muy similares (52% de identidad total) y contienen dominios de proteína quinasa en sus N terminales, y cremalleras de leucina (LZ) y motivos de hélice – bucle – hélice (HLH) en sus porciones C-terminales (Figura 2). IKKy no contiene un dominio catalítico reconocible, pero se compone principalmente de tres grandes regiones α-helicoidales, incluyendo una LZ (Figura 2). El análisis bioquímico de dos líneas celulares humanas indica que la forma predominante de IKK es un heterodímero IKKa:IKKß asociado con un dímero o trimer de IKKy (Rothwarf et al., 1998)., Se ha propuesto que una cuarta proteína, una proteína asociada al complejo IKK llamada IKAP, participe en la activación de IKK (Cohen et al., 1998). Sin embargo, como IKAP no es un componente fácilmente detectado del complejo IKK, su significado fisiológico y su función aún no están claras. Además, el análisis de secuencias sugiere que IKAP es el homólogo humano de uno de los componentes del complejo `Elongador’ de alargamiento transcripcional de levadura (Otero et al., 1999). Por lo tanto, IKAP es muy probablemente una proteína nuclear y, por lo tanto, es poco probable que sirva como un componente del complejo citoplasmático IKK.,
Los tres componentes de IkB kinasa (IKK). Se indican los principales motivos estructurales y funcionales de IKKa, IKKß e IKKy., Kinase D, kinase domain; LZ, leucine zipper; HLH, helix – loop – helix; α, α helical region capable of forming coiled-coils
como se mencionó anteriormente, los complejos IKK nativos purificados de células de mamíferos hasta ahora parecen ensamblarse solo a partir de heterodímeros IKKa:IKKß más un número indeterminado de IKKy subunidades (rothwarf et al., 1998). In vitro, IKKa e IKKß pueden formar homo-y heterodímeros de una manera que depende de la integridad de sus motivos LZ (Zandi et al., 1998)., Por lo tanto, es posible que los heterodímeros IKKa:IKKß se formen primero y luego interactúen con IKKy, que media la formación de un dímero de dímeros. De hecho, en las células con deficiencia de IKKy, IKKa e IKKß están presentes en un complejo de 300 kDa en comparación con el gran complejo de 700 – 900 kDa presente en las células de tipo salvaje (Yamaoka et al., 1998). El pequeño complejo de 300 kDa también se detecta cuando IKKa o IKKß están sobreexpresados (Zandi et al., 1997) y la reticulación indica que este complejo es un dímero de IKKa e IKKß (Zandi et al., 1998).,
Cuando se examinan como proteínas marcadas con epítopo expresadas transitoriamente en células de mamíferos, IKKa e IKKß exhiben una cinética de activación y especificidades de sustrato idénticas (Mercurio et al., 1997; Zandi et al., 1997). Sin embargo, es importante darse cuenta de que aunque son altamente reproducibles, tales experimentos son un tanto engañosos porque las proteínas expresadas transitoriamente intercambian fácilmente con sus contrapartes endógenas y se incorporan al gran complejo IKK (Zandi et al., 1997)., Por lo tanto, cuando se precipita la IKKa etiquetada con epítopo y se mide su actividad de la quinasa IkB asociada, no está claro si se está midiendo la actividad de la proteína IKKa exógena o las actividades de la IKKa o IKKß endógena con las que se asocia. Incluso se ha encontrado que mutantes catalíticamente inactivos de IKKa e IKKß se asocian con una cantidad sustancial de actividad de la cinasa IkB inducible por citoquinas tras la expresión transitoria (Zandi et al., 1997)., Sin embargo, la vasta sobreexpresión de IKKa o IKKß catalíticamente inactivo puede inhibir la activación de NF-kB en respuesta al TNFa, medida por la inhibición de la translocación nuclear de RelA (Zandi et al., 1997).
las actividades de la quinasa de IKKa e IKKß y sus habilidades para ser activadas dependen de su dimerización mediada por LZ, y las mutaciones de LZ que interfieren con este proceso suprimen la actividad de la quinasa IkB (Zandi et al., 1997, 1998). La actividad IKKa o IKKß también es abolida por mutaciones dentro del motivo HLH(Zandi et al., 1997, 1998)., Las mutaciones HLH, sin embargo, no interfieren con la dimerización o la unión a IKKy. Más bien, el motivo HLH parece interactuar con el dominio quinasa y puede estimular su actividad cuando se expresa en trans (Delhase et al., 1999).
la activación de IKK también depende de la presencia de una subunidad IKKy intacta. Ni la actividad IKK ni la NF-kB pueden ser inducidas en células con deficiencia de IKKy después del tratamiento con TNFa, IL-1, endotoxina o dsRNA (Yamaoka et al., 1998)., Además, los complejos IKK ensamblados en un mutante de truncamiento de IKKy que carece de su LZ C-terminal son refractarios a todos estos agonistas (Rothwarf et al., 1998). Estos resultados proporcionan una prueba genética de la importancia de IKK en la activación de NF-kB y sugieren que la región C-terminal de IKKy es necesaria para el reclutamiento de activadores aguas arriba (presumiblemente IKK-quinasas o IKK-Ks). Además, la sobreexpresión de IKKy puede inhibir la activación de IKK debido a la titulación de los activadores limitantes de IKK que quedan por identificar (Li et al., 1999b).,
la activación de IKK depende de la fosforilación de su subunidad IKKß (Delhase et al., 1999). La primera evidencia de un papel de la fosforilación en la activación de IKK se obtuvo mediante el tratamiento del complejo IKK purificado y activado con la proteína fosfatasa 2A (PP2A), que resultó en la inactivación de IKK (DiDonato et al., 1997). Además, el tratamiento de las células con ácido okadaico, un inhibidor de PP2A, resulta en una lenta activación de IKK (y en consecuencia NF-kB). Más recientemente, se demostró que la incubación de células con TNFa estimula la fosforilación de las tres subunidades IKK(Delhase et al., 1999)., IKKa e IKKß son fosforilados exclusivamente en serinas, mientras que IKKy es fosforilado en Serina y treonina. La ubicación de estas serinas ha sido cartografiada bioquímicamente solo para IKKß, pero se puede suponer que los sitios equivalentes también están fosforilados en IKKa. Dos de las serinas ikkß phospho-acceptor se encuentran en su bucle de activación(Delhase et al., 1999), una porción del dominio quinasa que es similar a una región involucrada en la activación dependiente de la fosforilación de otras proteínas quinasas (Zheng y Guan, 1994)., Con mayor frecuencia, la forma no fosforilada del bucle de activación se pliega en el dominio de la quinasa e interfiere con la entrada de ATP y sustratos peptídicos en el bolsillo catalítico. La fosforilación aleja el bucle de activación de la bolsa catalítica, permitiendo así la entrada y unión de sustratos (Johnson et al., 1996). El reemplazo de las dos serinas fosfoacceptoras (S177 y S181) en el asa T de IKKß con alaninas previene su activación, mientras que su reemplazo con residuos de glutamato fosfomimético causa activación constitutiva (Delhase et al., 1999; Mercurio et al., 1997)., Curiosamente, sin embargo, el reemplazo de las serinas equivalentes (S176 y S180) en IKKa suprime la autofosforilación de IKKa, pero no tiene ningún efecto en la estimulación de la actividad total de IKK asociada con el mutante IKKa(A176/A180) por TNFa, IL-1 o las quinasas aguas arriba MEKK1 y NIK (Delhase et al., 1999). Estos resultados fueron los primeros en señalar las diferencias funcionales entre las dos subunidades catalíticas, y estos resultados fueron confirmados más tarde por el análisis genético., Sobre la base de estos resultados, IKK se activa en respuesta a estímulos proinflamatorios a través de la fosforilación de IKKß; aunque la fosforilación IKKa es concurrente con la de IKKß, no es esencial para la estimulación de la actividad de la quinasa IkB. En otras palabras, la subunidad IKKß y no IKKa sirve como el objetivo para los activadores aguas arriba involucrados en la señalización proinflamatoria. Estos activadores son reclutados al complejo a través de la subunidad IKKy, muy probablemente a través de la interacción con su dominio C-terminal.
la fosforilación también puede resultar en una regulación negativa de la actividad IKK., Además de su bucle de activación, IKKß está ampliamente fosforilado dentro de una región ubicada entre su motivo HLH y el terminal C, que contiene múltiples serinas (Delhase et al., 1999). La fosforilación de estas serinas depende de la actividad de la autoquinasa y presumiblemente ocurre después de la fosforilación del bucle de activación. Los experimentos de mutagénesis indican que los sitios de autofosforilación C-terminal están involucrados en la regulación a la baja de la actividad de la quinasa (Delhase et al., 1999)., El reemplazo de nueve o diez de las serinas C-terminales de IKKß con alaninas resulta en un mutante que permanece activo cuatro veces más que la enzima de tipo salvaje, mientras que la sustitución de los mismos sitios con residuos de ácido glutámico fosfomimético resulta en una enzima mutante que apenas puede ser activada. Con base en estos resultados, se propuso un modelo de tres pasos para explicar la regulación de la actividad IKK (Figura 3; Delhase et al., 1999). Inicialmente, el inactivo complejo IKK no está fosforilado. En respuesta a los estímulos aguas arriba, los IKK – Ks son activados y reclutados para el complejo IKK a través de la subunidad IKKy., Esto resulta en la fosforilación del bucle de activación IKKß y la activación de IKK. Es probable que solo una pequeña fracción de IKK se active inicialmente a través de la fosforilación directa por IKK-Ks. Sin embargo, a través de la trans-autofosforilación la subunidad IKKß activada puede fosforilar una subunidad adyacente, que puede ser IKKa o IKKß, así como otros complejos IKK inactivos a través de una reacción intermolecular., En apoyo de esta suposición, la mera sobreexpresión de IKKß en células de insectos Sf9 es suficiente para su activación, y esta activación depende absolutamente de su autofosforilación. Los complejos IKK activados fosforilan las subunidades IkB en NF-kB:complejos IkB, desencadenando su degradación dependiente de ubiquitina, y la activación de NF-kB. Al mismo tiempo y tal vez debido a la disminución de la abundancia de IkB, las subunidades IKKß activadas (y presumiblemente las subunidades IKKa también) sufren autofosforilación C-terminal., Esta reacción, que es poco probable que sea procesiva, pero podría ser regulada por el nivel de IkB, funciona como un dispositivo de sincronización tal que cuando al menos nueve de las serinas C-terminales son fosforiladas, la enzima alcanza un estado de baja actividad. Una vez en este estado, IKK se vuelve sensible a la inactivación por fosfatasas, especialmente una vez que la señal aguas arriba Ha desaparecido., Como los sitios de autofosforilación C-terminal son adyacentes al motivo HLH, pueden ejercer su efecto negativo sobre la actividad de la quinasa al cambiar la conformación de este dominio activador de la quinasa intrínseca y afectar su interacción con el dominio catalítico. Este modo de regulación explica por qué IKK se activa generalmente de manera altamente transitoria.
los tres pasos del modelo para la regulación de la actividad IKK por fosforilación., Las dos subunidades catalíticas de IKK (IKKa e IKKß) se asocian en un heterodímero a través de sus cremalleras de leucina (LZ). En las células no estimuladas, el bucle de activación dentro del dominio de la quinasa (KD) no está fosforilado, y el motivo hélice – bucle – hélice (HLH) entra en contacto con el dominio de la quinasa. El C-terminal de fosforilación tampoco está fosforilado. Tras la estimulación celular con TNFa o IL-1, el bucle de activación de IKKß se fosforila y a través de la trans-autofosforilación de la segunda subunidad (IKKa o IKKß, en el caso de un homodímero) IKK se activa., Una vez activado, además de la fosforilación de IkBs, IKK se somete a autofosforilación progresiva en su C-terminal grupo de serina. Cuando al menos nueve de las serinas C-terminales son fosforiladas, la repulsión electrostática altera la interacción entre el motivo activador HLH y el dominio quinasa de tal manera que la quinasa alcanza un estado de baja actividad., En este estado, es probable que IKK sea más propenso a la inhibición por la acción de la fosfatasa
debido a la capacidad de IKKß para propagar su estado activo a través de la autofosforilación, es importante tener un mecanismo para disminuir su actividad quinasa y hacerla sensible a la inactivación por una fosfatasa. Sin autorregulación negativa, un solo bolo de una citocina proinflamatoria podría dar lugar a una activación prolongada de IKK que llevaría a una activación prolongada de NF-kB seguida de un aumento de la producción de mediadores inflamatorios primarios y secundarios., Como estos mediadores pueden causar una mayor activación de NF-kB (Barnes y Karin, 1997), existe un riesgo genuino de que, en ausencia de mecanismos eficientes de retroalimentación negativa, incluso un insulto proinflamatorio menor resulte en una catástrofe mayor, como el choque séptico.
curiosamente, sin embargo, la activación constitutiva de IKK puede ocurrir en Estados patogénicos y se documentó recientemente en células de la enfermedad de Hodgkin (Krappmann et al., 1999; revisado en Rayet y Gélinas, 1999, este número) y en células T infectadas por HTLV-1 (uhlik et al., 1998; revisado en Sun y Ballard, 1999, este número)., Aunque las bases moleculares para estas alteraciones en el comportamiento IKK son desconocidas, la activación constitutiva de NF-kB que sobreviene protege a estas células de la inducción de apoptosis por radio y quimioterapia (Bargou et al., 1997). De hecho, la elevada actividad de NF-kB e IKK puede proteger a numerosos tipos de tumores de las terapias que inducen la apoptosis (Gilmore, 1997). Por lo tanto, IKK es un objetivo atractivo para el desarrollo de nuevos fármacos antitumorales. Sin embargo, como se explicará más adelante, es probable que la inhibición completa de la actividad de IKK produzca efectos secundarios indeseables.
