Reordenamientos recurrentes de inversión de ADN en el genoma humano

resultados

justificación para el análisis de la dinámica del Genoma Humano.

para estudiar la dinámica del genoma humano, hemos apuntado a la detección de puntos de ruptura de reordenamiento cromosómico. Esto requiere la disponibilidad de una secuencia de referencia genómica de muy alta calidad. La actual secuencia del genoma humano cumple estos estándares de calidad, conteniendo pocas lagunas con un índice de error estimado muy bajo (26)., Para este estudio se utilizó la versión Build 36 de la secuencia genómica de referencia humana del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).

para identificar sitios potenciales para NAHR, la secuencia del genoma humano de referencia se analizó primero para encontrar regiones cromosómicas de alta identidad de secuencia. Si se produce un evento de recombinación mediada por NAHR, se espera que se formen nuevas estructuras genómicas., Además, si estos eventos ocurrieran en células somáticas, se predice que estas nuevas estructuras genómicas estarían presentes en una fracción muy pequeña del total de células analizadas, con la gran mayoría de las células que contienen la estructura genómica no reacomodada correspondiente (en este caso, estructuras de tipo salvaje). La evidencia de esto se puede encontrar en otros organismos, como las bacterias (24, 25). Por lo tanto, para identificar tales reordenamientos cromosómicos, es necesario un procedimiento experimental muy sensible y específico., En nuestra opinión, en la actualidad, la técnica de elección para este tipo de estudio sería un ensayo basado en PCR utilizando cebadores de oligonucleótidos adecuadamente definidos.

el presente estudio se centra en las inversiones de ADN derivadas de eventos NAHR entre pares de secuencias repetidas localizadas en orientación inversa que pueden generar inversiones de ADN. El esquema presentado en la Fig. 1 a ejemplifica un par de estructuras de tipo salvaje, denotadas como a y b, y el reordenamiento de inversión correspondiente que puede ser producido por NAHR (Fig. 1 B), junto con los cebadores PCR necesarios para detectar las diferentes estructuras., Los cebadores deben coincidir con las regiones proximales, aunque externas, a las repeticiones. Si se utilizan cebadores hacia adelante y hacia atrás que flanquean una de las repeticiones para el ensayo de PCR, se detecta la estructura de tipo salvaje correspondiente (Fig. 1 A). Se puede detectar un punto de interrupción de inversión utilizando ambos cebadores delanteros (Fa y Fb) o ambos cebadores inversos (Ra y Rb) (Fig. 1 B). De acuerdo con la posición de los cebadores correspondientes en la secuencia de nucleótidos, se puede calcular el tamaño exacto del fragmento de PCR esperado.

Selección de Secuencias Repetidas para Analizar la Dinámica del Genoma.

las regiones genómicas a estudiar fueron seleccionadas mediante un procedimiento bioinformático de varios pasos esquematizado en la Fig. 2., El primer paso consistió en la identificación de todos los pares de secuencias invertidas intracromosómicas formadas por dos núcleos, a y b, de al menos 400 nucleótidos de longitud que comparten 100% de identidad de secuencia (Ver materiales y métodos). Estos pares de secuencias se denominan secuencias invertidas recombinogénicas potenciales (PRI) (Fig. 2 A). Se encontraron un total de 24.547 PRI en la compilación NCBI 36 del genoma humano de referencia. Los PRI están distribuidos entre los 24 cromosomas diferentes, y los núcleos que comprenden estos PRI variaron en longitud de 400 a 74.868 nucleótidos., El número total de nucleótidos presentes en los PRI no redundantes fue de 31.115.694 PB, representando ≈1% del genoma humano. Posteriormente restringimos nuestra búsqueda a PRI formados por núcleos de menos de 4 kb de longitud y, por lo tanto, que podrían ser amplificados eficientemente por metodologías de PCR estándar (n = 24.001; Fig. 2 B), seguido de un criterio de búsqueda arbitrario adicional según el cual la distancia que separa los núcleos correspondientes de un PRI estaba entre 4 kb y 100 kb (N = 1.442; Fig. 2 C). La distribución genómica de este conjunto de PRI se muestra en la Fig. 3.

para diseñar cebadores apropiados que flanqueen los dos núcleos de los PRI correspondientes, la presencia de zonas de secuencia de ADN «única» aguas arriba y aguas abajo de cada núcleo es imprescindible. Aquí nos referimos a la secuencia de ADN» única » como una en comparación con los bordes correspondientes de cada núcleo del PRIS y no a todo el genoma., Es importante señalar que la mayoría de los núcleos están realmente inmersos en regiones homólogas más grandes que presentan una alta identidad, generalmente denominadas duplicaciones segmentarias (22). Determinamos el grado de identidad de la secuencia en las regiones adyacentes a los núcleos correspondientes de cada uno de los PRI por alineación global (Ver materiales y métodos) de la secuencia de ADN de cada núcleo extendido 2 kb aguas arriba y 2 kb aguas abajo. El análisis de los 1.442 alineamientos determinó que solo 76 PRI contienen zonas de secuencia de ADN «única» (Fig. 2 D).,

Además, la presencia de secuencias de ADN reiteradas en otras ubicaciones del genoma podría perjudicar el rendimiento de los cebadores PCR correspondientes. Los elementos reiterados más prominentes del genoma humano son las llamadas repeticiones comunes. Estas repeticiones incluyen repeticiones en tándem simples y de baja complejidad, como microsatélites y minisatélites, elementos nucleares intercalados cortos y largos, transposones de ADN y ARN ribosómicos y de transferencia, entre otros. Se determinó la presencia de repeticiones comunes en los bordes de cada núcleo de los 75 PRI (Ver materiales y métodos)., Solo se seleccionaron aquellos que presentaban al menos 200 PB de secuencia de ADN «única» desprovista de repeticiones comunes en ambos bordes de cada PRI. Esta selección resultó en un conjunto de 35 PRI viables (Fig. 2 E).,

En resumen, de acuerdo con las diferentes restricciones impuestas en el presente estudio, cada PRI operable está formado por dos núcleos, a y b, de secuencias de ADN invertidas intracromosómicas que comparten identidad al 100%, con un tamaño que oscila entre 400 y 4.000 nucleótidos, situados a una distancia entre 4 kb y 100 kb, y que presentan al menos 200 bp de secuencia única en las zonas situadas 2 kb aguas arriba y 2 kb aguas abajo de cada núcleo (ver esquema en la Fig. 2 E). Este conjunto funcional de PRI se distribuye entre la mayoría de los cromosomas y se destaca en la Fig., 3; las ubicaciones de los núcleos de cada PRI, sus tamaños y la distancia entre ellos se enumeran en la tabla 1 de información de apoyo (SI).

diseño de cebadores válidos para analizar la dinámica del genoma.

de este conjunto de PRI viables, seleccionamos arbitrariamente 10 para diseñar cebadores de PCR. A partir de nuestra Experiencia utilizando el método PCR para detectar reordenamientos en genomas bacterianos, nos hemos dado cuenta de que es importante diseñar y probar varios cebadores PCR que flanquean cada una de las secuencias repetidas seleccionadas (24)., En consecuencia, se diseñaron cuatro cebadores delanteros en la región aguas arriba y cuatro cebadores inversos en la región aguas abajo de los dos núcleos, a y b, de cada uno de los PRI seleccionados. El diseño de cada imprimación incluyó el análisis de sus sitios potenciales de cebado en todo el genoma y su capacidad para generar productos de PCR in silico cuando se combinan con otros imprimadores prospectivos (Ver materiales y métodos). Todos los cebadores seleccionados como in silico-valid fueron altamente específicos para detectar su región genómica correspondiente., Además, cuando se combinaron para detectar el reordenamiento de inversión correspondiente, no se reportaron Productos in silico.

de los 10 PRI seleccionados, pudimos diseñar cebadores PCR in silico-válidos para 8 de ellos (Fig. 2 F). Los 32 cebadores PCR correspondientes de cada uno de los ocho PRI seleccionados fueron sintetizados y probados experimentalmente. Las 16 combinaciones de oligonucleótidos para detectar cada uno de los núcleos del conjunto de ocho PRI en la configuración de tipo salvaje se utilizaron para preparar PCR utilizando una muestra de ADN derivada de células sanguíneas como objetivo., Solo se aceptaron los cebadores que producían un único producto de PCR del tamaño esperado. Si los geles de electroforesis para detectar los productos de PCR estaban sobrecargados, entonces, en algunos casos, se observaron bandas secundarias débiles; esta situación se consideró aceptable. De los productos PCR aceptables inferimos los cebadores PCR válidos.

para el análisis de los puntos de corte de inversión, se utilizó el conjunto de ocho PRI con cebadores PCR válidos. Cada PRI en este conjunto tenía al menos dos cebadores válidos hacia adelante y dos reversos válidos para cada núcleo (Fig. 2 G)., Todas las combinaciones de cebadores válidos se utilizaron para buscar los puntos de interrupción de inversión en cada PRI. Es importante señalar que, en contraste con las reacciones que detectan las estructuras de tipo salvaje, los PCR primarios para detectar el reordenamiento de inversión generalmente no produjeron bandas visibles después de teñir los geles con bromuro de etidio (ver más adelante). Se esperaba este resultado, ya que se espera que el número de células que contienen el reordenamiento objetivo esté muy diluido en la muestra que se está probando., Por lo tanto, las RCP secundarias, generalmente anidadas o heminestadas, se realizaron utilizando una alícuota del producto de la reacción primaria y todas las combinaciones posibles de cebadores apropiados. Evidencia potencial de un reordenamiento (Fig. 2 H) se consideró cuando la combinación apropiada de cebadores produjo un producto de PCR del tamaño esperado del fragmento reordenado y sin bandas secundarias. A partir de los ocho PRI analizados, en seis casos tuvimos evidencia potencial clara de reordenamientos de inversión., Para determinar que el producto de PCR era un fragmento recombinante que contenía las regiones correspondientes adyacentes al núcleo a en un extremo y al núcleo b en el otro extremo (ver arriba y Fig. 1), se obtuvo la secuencia de nucleótidos de los bordes de los productos PCR. Los fragmentos seleccionados presentaron una secuencia de ADN que coincidía con la de la región invertida esperada. En algunos casos, detectamos desviaciones menores de la secuencia de referencia que deberían corresponder a SNPs o mutaciones (datos no mostrados)., Los Seis PRI que mostraron evidencia de reordenamientos de inversión corresponden a números 5, 6, 7, 13, 22, y 27 en el cuadro 1 del SI. Cinco de ellos se encuentran dentro de genes humanos conocidos; en dos casos, los núcleos correspondientes se superponen con exones (PRIS 22 y 27), mientras que en los otros tres, ambos núcleos están contenidos dentro del mismo intrón (PRIS 5, 6 y 13).

montaje de Kits de reordenamiento.

para más experimentos, seleccionamos PRIS 27, ubicado en el cromosoma 19; PRIS 22, ubicado en el cromosoma 15; y PRIS 6, ubicado en el cromosoma 3., Estos PRI se denotarán aquí como región invertida 1 (IR-1), 2 (IR-2) y 3 (IR-3), respectivamente, y se indican en la Fig. 3. Para cada región, preparamos un conjunto de cebadores que constituyen un «kit de reordenamiento» (RKit) (Tabla 2 del SI). Cada RKit se compone de todos los cebadores PCR necesarios para realizar los PCR primarios y secundarios para detectar las siguientes estructuras específicas de cada región seleccionada: el núcleo a, el núcleo b y la estructura recombinante derivada de la inversión., Otro reactivo de cada RKit contiene un par de cebadores para obtener un fragmento de PCR de la secuencia idéntica correspondiente a los núcleos; cuando se etiqueta con radiactividad, este fragmento puede usarse como una sonda de hibridación para detectar cualquiera de los productos de PCR correspondientes a la región específica.

como se mencionó anteriormente, para validar los fragmentos correspondientes a los reordenamientos de inversión, se determinó la secuencia de nucleótidos de los bordes de los productos PCR correspondientes., Los productos PCR obtenidos con los cebadores específicos incluidos en los RKits correspondientes de las regiones IR-1, IR-2 e IR-3 fueron validados posteriormente. Cada producto de PCR fue clonado, y los bordes de los insertos de tres plásmidos recombinantes, que en todos los casos mostraron el tamaño del fragmento de ADN esperado, fueron secuenciados (Ver materiales y métodos)., Para todos los RKits utilizados en este estudio, la secuencia de nucleótidos tanto del producto de PCR como del inserto de los clones derivados de él determinó la presencia de los bordes esperados de los puntos de corte derivados del reordenamiento de inversión correspondiente. Los reactivos de los RKits se presentan en la Tabla 2 del SI. Un ejemplo de los productos de PCR que representan las diferentes estructuras de cada una de las regiones seleccionadas del genoma se muestra en la Fig. 4.

Características de las Regiones Seleccionadas para Detectar Reordenamientos Genómicos.

las regiones seleccionadas para analizar la ocurrencia de reordenamientos genómicos se esquematizan en la Fig. 5., Se muestran tanto la estructura de tipo salvaje como la derivada de una inversión debida a NAHR de los núcleos idénticos correspondientes.

los núcleos idénticos a y b de la región IR-1 son fragmentos de ADN de 941 PB separados por 36.925 PB. El núcleo A contiene el exón 7 y parte de los intrones 6-7 y 7-8 del gen SAFB2; el núcleo b contiene el exón 7 y parte de los intrones 6-7 y 7-8 del gen SAFB (Fig. 5 A). Los Genes SAFB2 y SAFB son genes paralógicos transcritos en la dirección opuesta. Se ha propuesto que la función de estos genes está involucrada en la organización de la cromatina, la regulación transcripcional, el empalme de ARN y la respuesta al estrés (27). Como se muestra en la Fig., 5 B, un reordenamiento de inversión derivado de NAHR mediado por los dos núcleos idénticos alteraría la estructura de los dos genes.

en la región IR-2, los núcleos idénticos son estiramientos de ADN de 482 PB separados por 24,129 PB. El núcleo A incluye el exón 7 y parte del exón 6, así como el intrón 6-7 y parte del intrón 7-8 del gen DUOX2 (Fig. 5 C). El núcleo b incluye el exón 8 y parte del exón 7, así como el intrón 7-8 y parte del intrón 8-9 del gen DUOX1 (Fig. 5 C). Estos genes han sido anotados como NADPH oxidasas y se ha encontrado que están altamente expresados en las células tiroideas (28)., En la región entre los genes DUOX2 y DUOX1, se encuentra otro gen, NIP. Como en el caso de SAFB2 y SAFB, los genes DUOX2 y DUOX1 son genes paralógicos transcritos en la dirección opuesta. En consecuencia, la inversión mediada por NAHR de los dos núcleos idénticos (Fig. 5 D) alteraría la estructura de los genes.

en el caso de la región IR-3, los núcleos idénticos son segmentos de ADN de 885 PB separados por 7.935 PB. Ambos forman parte de una estructura de repetición común, una repetición terminal larga, y están ubicados en el mismo intrón, intrón 3, del gen RNF13 (Fig. 5 E)., Este gen ha sido anotado como una proteína anillo de zinc dedo; su función específica no se ha determinado. La inversión resultante de NAHR entre los dos núcleos (Fig. 5 F) resultaría en una alteración menor de la estructura génica, localizada dentro de intrón 3, y presumiblemente no tendría relevancia fisiológica.

cinética temporal de la detección de reordenamientos por PCR.

utilizando los reactivos de un RKit, se realizaron PCR para detectar estructuras de tipo salvaje o reorganizadas. Se realizaron reacciones primarias y secundarias, y se analizaron las alícuotas en diferentes ciclos., Las alícuotas fueron sometidas a electroforesis en gel de agarosa y reveladas tanto por tinción de bromuro de etidio como por manchas del Sur hibridadas contra una sonda radiactiva. Un ejemplo usando la región IR-1 y un ADN Diana de Células Sanguíneas se presenta en la Fig. 6.

en la PCR revelando la estructura de tipo salvaje, la tinción de bromuro de etidio mostró el fragmento esperado desde la reacción primaria (Fig. 6 A), mientras que la estructura correspondiente al punto de ruptura de reordenamiento de inversión se reveló solo hasta la reacción secundaria, en este caso anidada (Fig. 6 C). Mediante el uso de manchas meridionales, podríamos demostrar que el fragmento que revela el punto de ruptura de la estructura reorganizada se está produciendo en realidad en la reacción primaria (Fig. 6 D).,

la cinética temporal de la PCR podría utilizarse como método semicuantitativo para estimar la proporción relativa de estructuras reorganizadas en comparación con estructuras de tipo salvaje. Sin embargo, esta técnica es solo una aproximación, porque la duplicación del producto de PCR en cada ciclo se obtiene generalmente en el caso de productos pequeños y bajo ciertas condiciones específicas, como las utilizadas para la PCR cuantitativa. Para cuantificar la proporción relativa de reordenamientos en una muestra de ADN, decidimos usar un método más confiable basado en la dilución del ADN objetivo (Ver más abajo).,

Cinética de dilución de la detección de reordenamientos por PCR.

cuando se diluye el ADN objetivo para una PCR y se prepara la reacción para detectar una estructura de tipo salvaje, se alcanza una dilución en la que no se encuentra ningún producto. Esta dilución debe estar cerca de una concentración de ADN objetivo de aproximadamente un genoma haploide por reacción. Por el contrario, si la reacción se prepara para detectar un reordenamiento, entonces la dilución en la que no se encuentra ningún producto debe ser proporcional a la concentración relativa del reordenamiento respectivo en la muestra de ADN. Un experimento típico se presenta en la Fig., 7 usando una muestra de ADN de células sanguíneas como objetivo. La estructura de tipo salvaje correspondiente al núcleo a de la región IR-1 dio PCR positivos hasta una dilución que contenía ≈10 pg de ADN por reacción; a una concentración de 3 pg por reacción, teóricamente ligeramente inferior a un genoma haploide por reacción, no se observó ningún producto de PCR (Fig. 7 A). Por el contrario, cuando la PCR fue preparada para detectar el punto de ruptura de inversión, la reacción que contenía ≈3 ng fue todavía positiva, mientras que las reacciones que contenían 1 ng o menos fueron todas negativas (Fig. 7 B).

es importante señalar que, como era de esperar, en las diluciones que presentan la última reacción positiva o la primera reacción negativa, algunas alícuotas presentan reacciones positivas y algunas negativas. Este hallazgo se ilustra en la Fig. 7 C y D para PCRs que detectan el reordenamiento de la inversión. De 24 alícuotas de la dilución que contenían 3 ng de ADN Diana por reacción, 17 fueron positivas (Fig. 7 C)., En la siguiente dilución, conteniendo 1 ng de ADN Diana por reacción, de 24 alícuotas solo 3 dieron reacciones positivas (Fig. 7 D). En diluciones que contienen 18 ng o más ADN objetivo por reacción, todas las alícuotas dieron una reacción positiva, mientras que en diluciones que contienen < 1 ng, todas las alícuotas dieron reacciones negativas (datos no mostrados)., La concentración relativa de ADN necesaria para producir una reacción positiva detectando el reordenamiento, comparada con la necesaria para producir una reacción positiva detectando la estructura de tipo salvaje, es proporcional a la concentración relativa de estructuras de tipo salvaje vs.reorganizadas en el ADN objetivo.

concentración relativa de estructuras reorganizadas en diferentes muestras de ADN derivadas de células somáticas.

la estrategia de dilución ejemplificada anteriormente se utilizó para detectar la concentración relativa de puntos de ruptura de reordenamiento en muestras de ADN de individuos no relacionados., El ADN se extrajo de células sanguíneas de recién nacidos (sangre del cordón umbilical) o de individuos adultos (Ver materiales y métodos). Para cada muestra de ADN, se utilizaron varias alícuotas de diferentes diluciones como objetivos para los PCR para detectar tanto el tipo salvaje (núcleo a) como la estructura reordenada correspondiente derivada de eventos de inversión de las regiones IR-1, IR-2 e IR-3. Se utilizaron varias alícuotas de diluciones apropiadas, y se calculó la concentración relativa del ADN objetivo para producir una reacción positiva detectando el tipo salvaje o la estructura reordenada correspondiente., La relación de la concentración de estructuras de tipo salvaje sobre la de estructuras reorganizadas de los diferentes ADN objetivo se presenta en una escala logarítmica en la Fig. 8.

Los ocho individuos probado presentado inversión de reordenamientos en las tres regiones analizadas. Sin embargo, la concentración relativa de los reordenamientos varió tanto entre muestras como entre regiones. En los extremos, una muestra de ADN recién nacida presentó ≈105 estructuras de tipo salvaje por una estructura invertida en la región IR-1 (individuo 6), mientras que algunas muestras adultas presentaron aproximadamente dos estructuras de tipo salvaje por una estructura invertida en la región IR-3 (individuos 1 y 3)., En todas las muestras, la región IR-3 presentó una mayor concentración relativa de estructuras reorganizadas que las regiones IR-1 e IR-2. El hallazgo más sorprendente fue que, para las tres regiones analizadas, el ADN aislado en el momento del nacimiento contenía una concentración significativamente menor de estructuras reorganizadas que la aislada de individuos adultos. La diferencia de los valores medios entre los dos grupos fue significativa para las tres regiones, IR-1 (P < 0,02), IR-2 (p < 0,001) e IR-3 (P < 0.,001), utilizando un análisis de varianza unidireccional. La razón de los valores medios entre ambos grupos fue de 17, 70 y 166 veces para las regiones IR-1, IR-2 e IR-3, respectivamente.